O型口蹄疫病毒VPl基因与大肠杆菌不耐热肠毒素LTB基因的融合表达及表达产物的免疫原性分析

以质粒pMDTLT为模板,用PCR的方法扩增出LTB基因,然后将其插入到pETVP1质粒中VP1基因的上游,构建了含有融合基因LTBVP1的表达质粒pETLTBVP1.转化宿主菌BL21(DE3)LysS后进行诱导表达,诱导菌经SDS-PAGE显示重组蛋白以包涵体的形式表达,分子量约为39 kD;Western blotting分析表明,重组蛋白能与FMDV阳性血清及兔抗霍乱毒素(CT)血清反应,说明融合蛋白保持了LTB和VP1各自的免疫学活性.小鼠免疫实验表明:该融合蛋白通过腹腔接种小鼠能诱导产生较强的免疫应答反应,免疫鼠产生的血清抗体水平高于试验中商品口蹄疫疫苗免疫组.     

人vWF-A1多肽的融合表达及生物学活性鉴定

血管性血友病因子 (vWF)通过与血小板膜糖蛋白结合介导血小板的粘附和聚集 ,在血栓形成过程中发挥重要作用 .通过阻断血小板与vWF的结合可抑制血栓形成 .应用RT PCR方法从人脐带内皮细胞中克隆vWF A1区基因并在原核细胞内进行表达 ,经过纯化、复性 ,获得重组蛋白(rvWF A1) .用流式细胞术检测rvWF A1与转染了糖蛋白Ib(GPⅠb)的CHO K1细胞和血小板GPⅠb的结合能力 ,血小板聚集仪测定rvWF A1对瑞斯托霉素 (ristocetin)诱导的血小板聚集作用的影响 .重组表达载体pET 2 0b(+ ) vWF A1在大肠杆菌BL2 1(DE3)plus中得到有效表达 ,表达的重组蛋白量占菌体总蛋白 30 % .次氮基三乙酸镍琼脂糖 (Ni NTAagarose)柱纯化后 ,其纯度为 95 % .经复性的rvWF A1蛋白具有良好的生物学活性 ,它可与转染了GPⅠb的CHO K1细胞和血小板结合 ,阳性率分别为 96 90 %与 78 6 0 % ,且可以抑制ristocetin诱导的血小板聚集 ,其抑制效应呈剂量依赖性 .IC50 的rvWF A1浓度为 0 5 6 μmol L ,当浓度为 1 4 μmol L时抑制率最高达 84 70 % .结果表明 ,在原核细胞中表达人rvWF A1区蛋白可抑制血浆中野生型vWF与血小板的结合 ,具有抗血栓形成的潜在应用前景     

人von Willebrand因子A1和A3功能结构域嵌合体的表达及生物学功能

vWF介导血小板粘附到细胞外基质 ,在血栓形成过程中发挥重要作用 ,可通过阻断vWF与细胞外基质的结合阻止血小板的粘附 .应用RT PCR方法从人脐静脉内皮细胞中克隆vWF分子A1、A3区基因并在大肠杆菌中表达 ,表达的重组蛋白量占菌体总蛋白 12 6 % ,包涵体经过变性剂溶解、纯化和复性 ,获得重组蛋白 (rvWF A1 A3) .应用流式细胞术检测rvWF A1 A3与血小板膜糖蛋白 (GPⅠb)的结合功能 ;血小板聚集实验观察rvWF A1 A3对瑞斯托霉素 (ristocetin)诱导的血小板聚集 (RIPA)的影响 ;ELISA胶原结合实验及竞争抑制实验分析rvWF A1 A3与胶原的结合活性 .结果显示 :rvWF A1 A3嵌合体与血小板的结合阳性率为 70 4 % .rvWF A1 A3嵌合体不能引起血小板的聚集 ,但rvWF A1 A3嵌合体与血小板温育后可以阻断ristocetin诱导人血浆vWF对血小板的聚集作用 ,而且呈剂量依赖性 ,IC50 的rvWF A1 A3浓度为 0 76 μmol L ,当浓度为 1 17μmol L时抑制率最高达 76 8% .rvWF A1 A3具有良好的胶原结合活性 ,同时它可以竞争性抑制vWF与Ⅲ型胶原的结合 ,抑制率为 76 % .表明rvWF A1 A3可作为阻断剂用于干预vWF介导的血小板粘附过程 ,同时又可以阻断血浆vWF与血小板GPIb结合抑制血小板聚集 ,具有良好的抗栓应用前景 .     

O型口蹄疫病毒VP1基因与大肠杆菌不耐热肠毒素LTB 基因的融合表达及表达产物的免疫原性分析

以质粒pMDTLT为模板、用PCR的方法扩增出LTB基因,然后将其插入到pETVP1质粒中VP1基因的上游,构建了含有融合基因LTBVP1的表达质粒pETLTBVP1。转化宿主菌BL21(DE3)LysS后进行诱导表达,诱导菌经SDS-PAGE显示重组蛋白以包涵体的形式表达,分子量约为39kD;Western blotting分析表明,重组蛋白能与FMDV阳性血清及兔抗霍乱毒素(CT)血清反应,说明融合蛋白保持了LTB和VP1各自的免疫学活性。小鼠免疫实验表明:该融合蛋白通过腹腔接种小鼠能诱导产生较强的免疫应答反应,免疫鼠产生的血清抗体水平高于试验中商品口蹄疫疫苗免疫组。     

膜型基质金属蛋白酶亚家族和基质金属蛋白酶-2在人恶性造血细胞株中的表达谱及其相关性

为探讨不同恶性血液病中膜型基质金属蛋白酶（memberane-type matrix metalloproteinases, MT-MMPs）和基质金属蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2,MMP-2）的表达差异,用半定量RT-PCR检测了13株不同谱系恶性造血细胞株中MT-MMPs和MMP-2的mRNA表达差异.明胶酶谱法分析各细胞株MMP-2的酶活,并用流式细胞术检测了MT1-MMP蛋白的表达,用SPSS10.0分析了各基因的表达与细胞来源的相关性和各基因相互间表达的相关性.结果提示,各种MT-MMPs和MMP-2在13株细胞中呈现不同的表达谱,其中MT2、MT4、MT1-MMP和MMP-2表达较广泛,而MT3、MT5、MT6-MMP在检测的细胞株中较少表达.统计分析显示,MT-MMPs和MMP-2的表达与细胞的来源无明显的相关性（P>0.1）,而MT1-MMP和MMP-2的表达有相关性（P<0.05）.同时也发现,MT3-MMP和MT5-MMP的表达有相关性（P<0.05）.MT-MMPs在恶性造血细胞中的表达差异,提示它们在不同类型的血液系统肿瘤发展中发挥各自独特的作用.另外,MT1 MMP和MMP-2,MT3-MMP和MT5-MMP之间表达的相关性提示,它们在功能上密切相关.     

鹌鹑和三黄鸡IFN-α cDNA的克隆及序列分析

根据GenBank已登录的鸡和鹌鹑IFN-α基因序列,用Oligo6.0设计一对能同时扩增鸡和鹌鹑INF-α基因的共用引物,利用RT-PCR方法从经ConA诱导培养的三黄鸡、鹌鹑外周血淋巴细胞中分别扩增到IFN-αORF全长cDNA,并克隆到pET-28a( )载体上。将测序结果分别与GenBank中已收录的家禽类IFN-α核苷酸序列进行同源性比较及遗传进化分析。结果发现鸡、鹌鹑IFN-αcDNA遗传进化稳定,与GenBank中收录的鸡、鹌鹑IFN-α核苷酸序列同源性为98.6%~99.8%、99.8%。鸡与其它家禽类的IFN-α核苷酸序列比较分析发现,与鹌鹑亲缘性较高,同源性达86.9%~87.1%,但与家水禽(鸭、鹅)差距较大,同源性最高也只有67.6%;鹌鹑IFN-α核苷酸序列与家水禽同源性在也只在62.7%~62.9%之间;基因遗传进化树分析可见家禽类IFN-α被分成两个大分枝,分别是由鸡和鹌鹑两个小分支组成的一个大分支与家水禽独立分支组成。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病RT-PCR快速鉴别诊断方法的建立与临床应用

根据高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)Nsp2基因的缺失信息,设计了3条特异性引物,以含高致病性PRRSV Nsp2基因的质粒pMDNSP2及普通PRRSV VR2332株RNA为模板,建立了快速诊断高致病性PRRSV RT-PCR方法.通过对临床组织病料的总RNA进行不同稀释倍数检测,结果表明该方法能从0.265 pg的总RNA中检测到PRRSV的基因,说明敏感性高.用该方法对猪瘟病毒(CSFV)、Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)、伪狂犬病病毒(PRV),链球菌(Streptococcus)、副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)和大肠杆菌(Escherichia coli)同条件检测,结果都为阴性.进一步对36份疑似高致病性PRRSV临床组织病料细胞培养物、2株PRRSV商品活疫苗以及52个猪场所送检的184份临床样品进行了检测应用,结果36份疑似高致病性PRRSV临床组织病料的细胞培养物有5份样品为阳性且都为高致病性PRRSV,2株PRRSV商品活疫苗为普通PRRSV,52个猪场中有42个猪场(123份样品)呈阳性,其中只有1份为普通PRRSV.实验表明该方法能够准确地鉴别诊断高致病性PRRSV和普通PRRSV,且具有快速,敏感和特异的特点,具有临床实用性.