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1.
3-甾酮-9α-羟基化酶(KSH)是微生物甾体降解途径中的关键酶,在甾体药物制备中有重要价值。以本实验室从土壤中自行筛选的分枝杆菌Mycobacterium sp.NwIB-01为出发菌株,利用红平红球菌Rhodococcus erythropolis SQ1已报道的ksh序列与已全基因组测序的分枝杆菌序列数据库进行比对分析,根据同源基因设计简并引物获得部分ksh序列,通过染色体步移扩增出全长ksh(命名为M.S.-ksh),该基因与耻垢分枝杆菌M.smegmatis mc2155的ksh同源性为85%。构建pET32-ksh表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3),获得高表达重组转化子菌株,经IPTG低温诱导,SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白主要为可溶性表达,表达量占菌体总蛋白的30%以上,用Ni2+亲和层析柱纯化,纯度达90%以上。本研究为利用基因工程菌进行工业化生产甾体药物奠定了基础。  相似文献   
2.
目的:以Streptomyces lividans TK24为表达宿主,构建高效表达棘白霉素脱酰酶(Ech DA)的基因工程菌。方法:从Actinoplanesutahensis NRRL 12052中获取Ech DA的基因片段,连接到链霉菌表达载体p NW-S1,采用诱导型启动子Plac与组成型启动子Perm E*和PSau3A,依次构建基因工程菌株ZNW-S11、ZNW-S12和ZNW-S13。通过分析启动子对Ech DA分泌表达的影响,确定工程菌的表达能力,随后完善发酵放大的工艺过程,将工程菌株发酵放大到300 L发酵罐水平。结果:成功实现了Ech DA在S.lividans TK24中的诱导分泌表达;在摇瓶水平,Ech DA的酶活可达到125U/L,在24h内可实现对15g/L米卡芬净前体FR901379的完全转化;在300L发酵罐水平,Ech DA的酶活可达到80U/L,可用于10g/LFR901379的完全转化。当前,国内在工业生产中仍使用原始菌A.utahensis来表达Ech DA,而开发的Ech DA基因工程菌,与之相比在生产效率上有了大幅度提升,有助于改良当前棘白霉素类抗生素的生产工艺。  相似文献   
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