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1.
根据漆酶铜结合保守区氨基酸序列设计简并引物,从新型漆酶合成菌株栓菌420(Trametes sp.420)基因组DNA扩增得到一新的漆酶同工酶基因(lacC)片段,应用长距离反向PCR技术获得其两端侧翼序列。克隆得到的lacC序列长3640bp,包括长2263bp的开放读码框及5′和3′-非编码区。lacC cDNA序列长1560bp,编码一519aa的多肽。推导的LacC蛋白序列内部存在有10个潜在的N-糖基化位点和4个铜原子结合区。将不含自身信号序列的lacC cDNA以pPIC9载体为媒介克隆到表达载体pPIC9K上,转化毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115细胞。重组菌在含有0.3mmol/LCuSO4和0.8%丙氨酸的BMM培养基中20℃培养9d,重组漆酶(rLacC)产量达到1.62×104U/L。用发酵粗酶液对终浓度50mg/L的染料进行脱色实验,结果表明,6U/L的rLacC对测试的三甲基类和偶氮类染料具有良好的脱色作用,小分子介体ABTS和HBT能够提高rLacC对染料的脱色效率和脱色速度。  相似文献   
2.
目的:木素过氧化物酶在工业和环保方面具有潜在应用价值。从腐木上分离得到一株新的木素过氧化物酶合成菌,该菌株具有香栓菌(Trametes suaveolens)的形态特征,需要对其进一步确认。方法:用rDNAITS序列的分子分类方法对该菌株进行鉴定。结果:PCR得到的ITS片段长621bp,其序列与一株香栓菌具有最高的相似性(97.6%),并明显不与栓菌其他种聚类。结论:该分离种为一株新的香栓菌,命名为T.suaveolens1523。  相似文献   
3.
栓菌漆酶在毕赤酵母中高效表达及重组酶的性质   总被引:1,自引:0,他引:1  
栓菌420(Trametes sp.420)漆酶基因lacD以两种方式在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)进行异源表达,产生两种重组漆酶:rLacDx(具有天然N-末端)和rLacDe(N-末端带有8个额外的氨基酸残基)。摇瓶发酵18d,rLacDx和rLacDe的产量分别为1.21×105u/L、7.38×104u/L[以2,2′-连氮-3-乙苯-二噻唑-6磺酸(ABTS)为底物]。在高密度发酵条件下,rLacDx的产量增加到2.39×105u/L,同时其生产周期降至7.5d。两种重组酶对愈创木酚底物的氧化特性相似,且在50℃和pH3~10的范围内均稳定。然而,rLacDx对底物ABTS的比活力(1761u/mg)高于rLacDe(1122u/mg),其表观Km值(427μmol/L)低于rLacDe(604μmol/L)。  相似文献   
4.
栓菌420漆酶同工酶B基因克隆及异源表达   总被引:1,自引:0,他引:1  
根据铜结合区的保守氨基酸序列设计简并引物,扩增栓菌420(Trametessp.420)基因组,结合长距离反向PCR(LD-IPCR)技术,克隆得到新型漆酶同工酶B基因(lacB),包括结构基因(2255bp)及5′-和3′-非编码序列。lacB含12个内含子,其cDNA序列长1560bp,编码495aa成熟多肽和24aa信号肽。lacB与其它不同来源的真菌漆酶基因具有较高的同源性,而与植物、细菌、昆虫的漆酶基因同源性低于25%。将不含信号序列的lacBcDNA通过质粒pPIC9克隆到表达载体pPIC9K上,电击转化毕赤酵母GS115细胞,经BMM-ABTS平板筛选得到漆酶分泌阳性转化子。  相似文献   
5.
对中药植物茜草(Rubia cordifoliaL)的内生菌进行了分离和抗菌活性筛选,获得一株具有广谱抗菌活性的内生细菌。该细菌对常见的3种人类病原菌和4种植物病原菌具有拮抗作用。传统分类学和基于16S rRNA基因的分子分类学证据表明,该内生细菌为一株新的枯草芽孢杆菌,命名为Bacillus subtilisRC4。B.subtilisRC4在综合马铃薯培养基(pH值5.0)中于28℃振荡培养60h,产生的代谢物对白色念珠菌的抗菌活性最强。抗菌活性物质在100℃受热20min,活性维持80%以上,且在pH值2.0~11.0范围内稳定。经硅胶柱层析和高效液相色谱分离,得到主要抗菌活性化合物,质谱分析表明其分子量约为288Da。  相似文献   
6.
Trametes sp. AH28-2漆酶同工酶的合成需要铜离子的存在,较高浓度的Cu2+有利于漆酶合成。在以葡萄糖为碳源补加0.5mmol/L Cu2+的培养基中生长时,发酵液漆酶活性为44.3u/L,同时补加4.0mmol/L邻甲苯胺时,漆酶酶活提高到71.0u/L;而在补加Cu2+和邻甲苯胺的纤维二糖培养基中,酶活上升至2584u/L,为葡萄糖培养基的36.4倍。邻甲苯胺和铜离子诱导产生的漆酶同工酶组分,均为漆酶A(LacA)。竞争性RT-PCR分析表明,漆酶A基因(lacA) 转录本的累积伴随有发酵液漆酶活性的增加,邻甲苯胺对lacA的调控发生在转录水平。lacA 结构基因长2110bp,含有10个内含子;lacA的Cdna序列为1560bp,编码520aa的漆酶蛋白,其氨基酸序列与其它真菌漆酶具有较高的相似性。采用改进的反向PCR技术,扩增得到的lacA5′-端调控区长1881bp,分析表明,该区域上分布有1个TATA框、7个CAAT框和多个潜在的顺式作用元件序列位点,包括5个MRE元件、9个CreA结合位点、4个XRE元件、2个STRE元件和7个氮因子调控位点等。这些序列位点的存在部分地对应了菌株摇瓶发酵条件下lacA的表达规律。  相似文献   
7.
栓菌420(Trametes sp. 420)漆酶基因lacD以两种方式在巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)进行异源表达,产生两种重组漆酶:rLacDx(具有天然N-末端)和rLacDe(N-末端带有8个额外的氨基酸残基)。摇瓶发酵18d,rLacDx和rLacDe的产量分别为1.21×105u/L、7.38×104u/L [以2,2′-连氮-3-乙苯-二噻唑-6磺酸(ABTS)为底物]。在高密度发酵条件下,rLacDx的产量增加到2.39×105u/L,同时其生产周期降至7.5 d。两种重组酶对愈创木酚底物的氧化特性相似,且在50℃和pH3~10的范围内均稳定。然而,rLacDx对底物ABTS的比活力(1761u/mg)高于rLacDe (1122u/mg),其表观Km值(427μmol/L)低于rLacDe (604μmol/L)。  相似文献   
8.
长距离反向PCR技术高效扩增已知DNA片断的侧翼序列   总被引:4,自引:0,他引:4  
为解决传统反向PCR技术扩增片段短、假阳性多的不足,建立了长距离反向PCR(LD I-PCR)扩增技术:0.5μg DNA/mL的反应体系使DNA酶解片段充分自身环化连接,其产物用25 nt~30 nt的序列特异引物进行长距离PCR。结果表明该方法能特异地扩增出长达16 kb的序列,在已知DNA片段的侧翼序列克隆方面具有高效、简便、特异的优点。  相似文献   
9.
固定化真菌漆酶降解氯苯嘧啶醇农药   总被引:4,自引:0,他引:4  
在葡萄糖培养基中,栓菌420(Trametes sp.420)经6mmol/L邻甲苯胺诱导,漆酶活力达到4535U/L(愈创木酚法)。用弱阴离子交换层析可分离得到纯化漆酶。以壳聚糖为载体,戊二醛为交联剂对漆酶进行固定化,30g壳聚糖与30U漆酶混合,酶活回收率高达69%。在酸性条件下,固定化漆酶对农药氯苯嘧啶醇具有良好的降解作用。  相似文献   
10.
灵芝漆酶转化除草剂2,4-D丁酯的初步研究   总被引:1,自引:0,他引:1  
来自灵芝ST(Ganoderma sp.ST)的漆酶在无氧化还原介质存在时能够直接转化苯氧羧酸类除草剂2,4-D丁酯。对酶转化2,4-D丁酯的条件进行了优化,包括pH值、给酶量和反应温度。灵芝ST漆酶在pH值4.0~8.0和15~30℃的范围内均能够有效转化2,4-D丁酯(初始浓度0.5mg/L),在最适的pH值7.0、给酶量25U/L和温度30℃条件下,转化率随着酶作用时间的延长而提高,在24h左右达到最高(〉99.5%)。酶活力在作用时间内稳定,并且用自来水代替缓冲液获得的转化率相当。  相似文献   
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