斑鳢、乌鳢及其杂种细胞核DNA流式含量分析

以斑鳢(Channa maculata)、乌鳢(C.argus)及其正交杂种斑乌鳢(斑鳢♀×乌鳢♂)和反交杂种乌斑鳢(乌鳢♀×斑鳢♂)的红细胞为材料,以鸡(Gallus gallus)血细胞为DNA标准(2.5 pg/2c,2c指2倍体),采用流式细胞仪测定了这4种鱼的细胞核DNA含量。斑鳢、乌鳢、斑乌鳢及乌斑鳢这4种鱼血细胞DNA的绝对含量分别为(1.488±0.035)pg/2c、(1.489±0.034)pg/2c、(1.522±0.077)pg/2c和(1.520±0.033)pg/2c。斑鳢和乌鳢的细胞核DNA含量差异不显著(P0.05),斑鳢和乌鳢与两种杂交鳢的DNA含量差异显著(P0.05),两种杂交鳢之间的细胞核DNA含量差异不显著(P0.05)。杂交鳢细胞核DNA含量显著高于亲本,可以作为杂种鉴定的依据。     

中华鳖5个群体遗传多样性的微卫星分析

利用微卫星分子标记技术对洞庭(DT)、黄河(HH)、黄沙(HS)、日本(RB)以及洞庭(DT)与黄河(HH)的杂交子代(DT♀×HH♂)绿卡(LK)5个中华鳖群体的150个个体进行遗传多样性分析。11对微卫星引物扩增出的等位基因数为3～6个,平均等位基因数为4.1818。5个种群相比,绿卡(LK)的平均有效等位基因数、平均期望杂合度、平均观测杂合度和平均多态信息含量最高,分别是2.3969、0.5274、0.5545和0.4660。对种群间的遗传分化分析表明,黄河(HH)和洞庭(DT)之间的遗传分化最小,为0.0233,而洞庭(DT)和日本(RB)之间的遗传分化最大,为0.0969。基于Nei’s遗传距离构建的UPGMA系统进化树显示黄河(HH)和洞庭(DT)及其子代绿卡(LK)亲缘关系较近,而与黄沙(HS)和日本(RB)的亲缘关系较远,最远的为日本(RB)群体。     

鼋骨骼系统及与中华鳖比较

采用虫蚀法制备了鼋Pelochelys cantorii和中华鳖Pelodiscus sinensis的骨骼标本, 对骨骼系统进行了观察、描述、绘图及比较分析。结果显示, 鼋的骨骼共169枚, 由背甲和腹甲组成的外骨骼、中轴骨和附肢骨组成的内骨骼组成。通过比较鼋和中华鳖的骨骼结构, 发现二者在头骨的吻突长度及第三颈椎结构方面有较大差别。鼋眼眶前部至吻突最前端的长度与头骨总长度比为0.082, 而中华鳖为0.570, 显示中华鳖吻突显著长于鼋。鼋与中华鳖的颈椎骨数目均为9枚, 但中华鳖的第三至第九颈椎的横突要更明显, 第七颈椎的椎体向上显著翘起, 且第九颈椎腹面椎体前端为尖状。从整条颈椎上看, 鼋脊椎长度与其背甲长度之比为0.66, 中华鳖为1.07, 表明中华鳖的颈椎更长; 研究结果丰富了鳖科动物的骨骼学基础数据, 也为鼋物种鉴定、龟鳖动物系统演化及生态适应性提供骨骼学理论依据。     

中华鳖GHRL基因SNPs的筛选及生长性状的关联分析

为探究GHRL基因多态性对中华鳖(Pelodiscus sinensis)生长性状的影响, 采用直接测序法在GHRL基因上检测到14个单核苷酸多态性位点C289T、G501T、T738C、G776T、A841G、T885C、T2960C、A2987T、G3390A、A3857C、G4718A、T4820C、A4850C、T4979C。随机选取同批繁殖的120只中华鳖用飞行时间质谱法进行SNPs位点的分型, 并分析与生长性状的相关性。检测结果显示, 所有SNP位点均符合Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05)。方差分析结果显示, C289T位点CT、CC基因型的5项生长数据均显著高于TT基因型(P<0.05)。S2位点AB基因型的体重、背甲长、背甲宽和裙边宽4项数据均显著高于AA基因型(P<0.05)。G3390A位点AG基因型的背甲长、背甲宽2项数据显著高于AA基因型(P<0.05)。G4718A位点AG基因型的背甲长、背甲宽、裙边宽3项数据显著高于AA基因型(P<0.05)。在GHRL基因上获得的SNP位点可能影响着中华鳖的生长性状或与之紧密连锁, 可为中华鳖分子辅助育种提供助力与参考。     

基于微卫星标记的鼋亲子鉴定技术

为研究鼋(Pelochelys cantorii)保种群体的遗传信息,利用鼋转录组文库, 筛选出了10对微卫星引物, 以此建立了基于 2 组各含5个微卫星位点多重 PCR 体系的鼋亲子鉴定技术, 并应用 2 组微卫星多重 PCR 体系, 通过 ABI3130 遗传分析仪及 PopGene3.2和CERVUS软件对56只子一代鼋进行个体基因型检测和群体遗传多样性分析, 结果显示, 鼋子一代群体的平均等位基因数为2.3, 微卫星位点的平均多态信息含量为0.3829, 平均观测杂合度和期望杂合度分别为0.6305和0.4767, 处中高度水平。对子代进行亲子分析, 10个微卫星位点的累积排除概率分别为73.14%(NE-1P)、90.98%(NE-2P)和98%(NE-3P), 能够满足亲子鉴定的需要。且4只亲本在生殖选择中表现出差异。鼋多重 PCR 亲子鉴定技术的建立为群体遗传多样性分析、家系鉴定管理和选择育种提供了有效的技术手段。     

中华鳖GHSR基因SNPs的筛选及生长性状的关联分析

为探究GHSR基因多态性对中华鳖(Pelodiscus sinensis)生长相关性状的影响,采用直接测序法在GHSR基因5'侧翼和3'侧翼上筛选SNPs位点,共检测到5个单核苷酸多态性位点:A335T、G397T、A527G、A13482C和T13526A。随机选取同批繁殖的1冬龄200只中华鳖用直接测序法进行SNPs位点的分型,并分析与生长性状的相关性。检测结果显示,所有SNP位点均符合Hardy-Weinberg平衡状态(p>0.05)。方差分析显示,A336T位点的AT、TT基因型的体重、背甲长、背甲宽和裙边宽4项生长数据均显著高于AA基因型。A13482C位点的AC基因型的体重、背甲长、背甲宽和裙边宽4项数据均显著高于AA基因型(p<0.05)。研究表明,本实验在GHSR基因上获得的这些SNP位点可能影响着中华鳖的生长性状或与之紧密连锁,可为中华鳖分子辅助育种提供助力与参考。     

中华鳖组蛋白H2A变体克隆及其在卵母细胞中的表达分析

为研究组蛋白H2A对龟鳖动物生殖细胞发育分化作用和机制, 克隆了中华鳖(Pelodiscus sinensis)组蛋白H2A变体的同源物(命名为PsH2A), 分析其转录本的表达模式及在卵巢发育成熟过程中的细胞定位。PsH2A cDNA序列全长575 bp, 5′端非编码区68 bp, 3′端非编码区108 bp, 开放阅读框399 bp, 编码133个氨基酸。氨基酸序列比对结果显示其与龟类的H2A变体同源性更高, 与哺乳类同源性较低。RT-qPCR和RT-PCR结果显示, PsH2A转录本在1冬龄、2冬龄和3冬龄的中华鳖卵巢中高表达(P<0.01), 而在精巢和其他成体组织中几乎检测不到。化学原位杂交结果显示, PsH2A mRNA在卵母细胞中特异性表达, 其中初级卵母细胞中表达信号最强, 且均匀的分布在细胞质中。随着卵母细胞发育成熟进入到生长期和成熟期后, 目的信号逐渐减弱, 并且主要在核周区域表达。此外, PsH2A mRNA的相对表达量也表现出中华鳖卵巢发育的季节性变化。综上, 研究结果表明PsH2A在中华鳖卵母细胞发育过程中可能发挥着重要作用。     

人工驯养鼋繁殖习性研究

鼋(Pelochelys cantorii, 1864)属于中国国家一级重点保护野生动物, 生物学资料相对匮乏, 2015和2016年连续2年对人工驯养的4只亲鼋(2雌2雄)进行了繁殖生物学研究。人工驯养鼋的产卵期集中在5—8月, 夜间产卵, 无护卵行为。通过视频观察分析, 鼋产卵过程可分为Ⅳ个阶段。2只雌鼋2015年共产卵10窝, 每窝32—50枚, 共406枚, 受精273枚, 受精率为67.24%, 孵出稚鼋140只, 孵化率为51.28%; 2016年共产卵11窝, 每窝40—55枚, 共489枚, 受精353枚, 受精率为72.19%, 孵出稚鼋212只, 孵化率为60.06%。鼋卵圆形, 刚性, 均重(16.82±1.99) g, 卵直径(3.10±0.18) cm, 刚孵出稚鼋均重(13.60±0.85) g, 在人工控温下平均孵化期为(64.94±3.47)d。繁殖数据表明这2对鼋处于生育盛年期。针对2016年的繁殖数据分析, 2只雌鼋每窝产卵量无明显差异, 卵均重和卵直径间有显著相关性, 雌鼋1个体体重大于雌鼋2, 前者产的卵均重显著大于后者, 孵出稚鼋的初重差异也显著, 卵大, 稚鼋也大。孵出的稚鼋以活鱼苗为饵料, 在温室内人工养殖周年, 均重可以达(510.30±82.77) g。研究旨在为鼋繁育生物学提供基础性数据, 为其资源保护做贡献。     

美洲鲥雄性生殖细胞冷冻保存及移植

采用分离细胞冻存和组织块直接冻存2种方法, 进行美洲鲥(American shad, Alosa sapidissima)精巢细胞的长时间冷冻保存(>250d), 并比较分析2种不同冻存方法对美洲鲥雄性生殖细胞的冻存效果。解冻复苏后用Hochest33342和PI共染细胞核, 分析统计各期雄性生殖细胞的存活率, 结果显示组织块冻存方法所得精原干细胞和精母细胞的存活率明显高于分离细胞冻存的; 而精细胞及其他细胞存活率在2种方法间无显著差异; 特别是, 镜检发现组织块冻存方法所得精子存活率高达93.83%, 说明此冻存方法能同时高效地冻存美洲鲥各期生殖细胞, 包括成熟的精子。同时, 将组织块冻存的美洲鲥生殖细胞用PKH26染色标记后移植到出苗第1天的斑马鱼仔鱼中, 在细胞植入后5d仍能在受体中检测到供体细胞, 且有部分供体细胞能与内源生殖细胞共定位, 表明经过长时间冷冻保存的美洲鲥生殖细胞仍具有生殖细胞特性, 且能整合到斑马鱼受体性腺原基。研究结果为进一步开展美洲鲥, 或其他洄游性鱼类的生殖细胞发育、培养及种质资源保存等研究工作奠定了技术理论基础。     

美洲鲥胚胎及仔稚鱼的发育

对美洲鲥(Alosa sapidissima)早期生活史阶段的生长发育特征进行了观察和测量, 描述了胚胎和仔、稚鱼的生长发育特征。美洲鲥受精卵球形、无油球, 为沉性卵, 卵径2.85-3.28 mm。在水温20.3℃-21.9℃孵化条件下, 经过82h 孵化出膜, 根据其胚胎发育过程的形态特征, 胚胎发育分为受精卵、卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、器官形成期和出膜期7 个发育阶段。美洲鲥初孵仔鱼全长为(8.56±0.36) mm, 其卵黄囊体积为(4.57±0.77) mm3。1 日龄仔鱼脑部发育明显, 口张开, 肛门开通, 胸鳍形成。2 日龄仔鱼卵黄囊体积(0.71±0.23)mm3, 只有刚孵化的15.54%。3 日龄仔鱼经过1d 的混合营养期, 卵黄被完全吸收, 4 日龄仔鱼完全营外源性营养, 卵黄囊的体积(V)随孵化时间(h)的变化方程为V=4.1583e?0.0356h(R2=0.9901)。此后, 背鳍鳍条、尾鳍鳍条、臀鳍鳍条和腹鳍鳍条相继在晚期仔鱼出现, 9 日龄仔鱼尾椎开始弯曲, 21 日龄仔鱼尾椎弯曲完成。27 日龄鱼鳞开始形成, 到33 日龄稚鱼全身披鳞, 个体发育进入幼鱼期, 仔稚鱼期间的生长模型方程为: TL=0.0049D2+0.5091D+9.2578 (R2=0.9885, TL 为全长, D 为日龄)。