三角酵母D-氨基酸氧化酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

从三角酵母中提取总RNA ,反转录后进行PCR扩增得到D 氨基酸氧化酶 (D AminoAcidOxidase ,DAAO)基因 ,经测序可知 ,与文献中三角酵母的DAAO基因序列的同源性在 99%以上。将DAAO基因用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后 ,与相同酶切的大肠杆菌表达载体pET 2 8a连接 ,转化大肠杆菌TOP 1 0F′,并筛选得到重组质粒pET DAAO ,转化BL2 1 (DE3)感受态细胞 ,得到重组大肠杆菌BL2 1 (DE3) pET DAAO。对重组大肠杆菌中的D 氨基酸氧化酶进行了诱导表达 ,考察了诱导温度、菌浓度、诱导剂IPTG用量以及溶氧等因素对酶活的影响。结果表明 ,在 2 8℃、菌浓度 (OD6 0 0 ) 1 0、IPTG浓度 1mmol L时 ,DAAO酶活最高达 2 3 3U mL。研究进一步显示 ,用廉价无毒的乳糖可以替代IPTG进行诱导 ,当乳糖浓度为 2mmol L ,DAAO酶活可达 2 2 7U mL。经过补料分批培养和乳糖诱导 ,DAAO酶活可以达到 1 75U mL。     

腈水合酶基因克隆与调控表达的研究进展

微生物腈水合酶作为新型生物催化剂得到日益广泛的应用 ,但野生菌株本身存在的酶稳定性差等问题制约了这一绿色工艺的发展 ,基因工程菌为解决这个难题开辟了新的思路。总结了各种菌株中腈水合酶的序列研究进展 ,虽然基因序列和蛋白序列同源性不高 ,但它们都以基因簇的形式存在 ,并具有相同的活性中心序列。归纳了克隆并表达腈水合酶基因的基本步骤和方式 ,并提出几种有效增强重组腈水合酶活性表达的方法。     

微生物法生产丙烯酰胺的研究（Ⅱ）——腈水合酶催化反应动力学与失活动力学

以丙烯腈为原料,微生物转化生产丙烯酰胺的过程中,酶催化反应是过程的关键。为了了解酶催化的动力学,本研究以自由细胞的酶为催化剂,进行了腈水合酶的反应动力学和失活动力学的研究。首先研究了菌体浓度、温度、pH值、丙烯腈浓度、丙烯酰胺浓度等对腈水合酶催化反应速度的影响。结果表明,在这些因素中,温度和丙烯酰胺浓度是最主要的影响因素。28℃时酶活为5659u/mL（菌液）,在5℃时的反应速率仅为28℃时的11.72%,相应的表观酶活为663u/mL（菌液）。而在丙烯酰胺45%浓度条件下的酶活大约只有丙烯酰胺5%浓度下的酶活的1/2。经过对不同温度下的反应速度的研究,得到腈水合酶水合反应的活化能为65.57kJ·mol^-1。本文进一步研究了自由细胞状态下,菌体浓度、pH值、温度、丙烯腈浓度、丙烯酰胺浓度对腈水合酶失活的影响,得到了失活动力学。结果表明,在这些因素中,对酶失活影响的最主要因素还是温度和丙烯酰胺浓度。尤其当丙烯酰胺浓度到达35%时,酶活下降得很快,在55 h后,酶活几乎为零。而在丙烯酰胺浓度为10%的情况下,55 h的酶活仍然还存在约50%。试验结果还表明,丙烯腈对酶的稳定性的影响很小。经过数据处理,得到的28℃的酶失活速率常数为5℃下的2177倍。经过对温度与失活速率常数的拟合,得到腈水合酶失活反应的活化能为9228kJ·mol-1。     

用SDS．NaClO从重组大肠杆菌中分离聚-β-羟基丁酸酯

聚β羟基丁酸酯（ＰＨＢ）是微生物合成的一种以颗粒状态存在于细胞中的高分子聚合物,由于它具有生物可降解性、生物相容性等特性,在医学上具有独特而广阔的应用前景。从微生物细胞中分离ＰＨＢ的方法有溶剂萃取法［１］、化学试剂法［２４］和酶法［５］。目前工...     

细胞絮凝技术及在生物产品分离中的应用

本文综述了一种生化分离技术──细胞絮凝技术。从絮凝剂种类、絮凝机理和动力学、絮凝设备等方面进行了讨论,并且介绍了细胞絮凝技术在污水处理、连续发酵、产品分离中的应用及亲和絮凝技术的进展。     

利用噬菌体破细胞壁分离胞内产物的展望

介绍了利用噬菌体破细胞壁的两类方法;构建可诱导裂解的溶源菌和克隆可诱导裂解的噬菌体裂解基因。对λ噬菌体裂解细胞的行为进行了详细分析。以产聚－β－羟基丁酸酯（ＰＨＢ）的重组大肠杆菌为例,提出将带有琥珀突变的λ噬菌体的裂解基因Ｓ＾－ＲＲｚ和目标产物的基因克隆到同一质粒上,以用来破细胞壁生产目的产物的方法,可望解决细胞中产物积累量最大和细胞破碎率最高的矛盾,具有一定的应用前景。     

用快速琼脂糖层析纯化磷酸甘油酸激酶及磷酸甘油醛脱氢酶

研究了用快速琼脂糖离子交换层析(DEAE—Fast Flow sepharose)结台PEG 4000／Reppal PES双水相体系从黄豆中分离纯化磷酸甘油酸激酶(PGK)及磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)。控制床层高度(10～20cm),径向放大具有压降低的优点．设计多点进料取代传统的中心管进料,解决了径向流场不均匀的问题。GAPr)H的总收率及纯化倍数分别为58％和144,PGK的总收率及纯化倍数分别为41％和44。工艺成本为2．92美元／ku GPADH,具有一定的实用价值。     

产腈水解酶菌株的诱变及培养优化

对实验室保存的1株产腈水解酶的Rhodococcus rhodochrous菌株采用氯化锂进行诱变处理,筛选得到了1株产酶活力较高的菌株tg1-A6。经过优化得到培养基的配方为(g.L-1):葡萄糖10,谷氨酸钠10,酵母膏3,己内酰胺7,MgSO40.5,K2HPO40.75,KH2PO40.75。当培养温度28℃,摇床转速200 r.min-1,初始pH值7.0,通过补加葡萄糖,该菌的腈水解酶酶活可达到26.77 U.mL-1。     

高效测定发酵液中透明质酸含量的改良CTAB浊度法

透明质酸（HA）在保健品、化妆品及临床医疗等领域都具有重要应用,发酵法是HA生产的主要方法。发酵液中HA含量的快速、准确测定对于HA的生产具有重要意义。在原始十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）浊度法测量HA浓度的基础上,提出了去除HA与乙酸缓冲液混合后的水浴步骤、降低CTAB试剂浓度（2.5 g/L）以及确定HA-CTAB络合反应时间（5 min）的改良CTAB法。进一步研究了发酵液各成分对改良CTAB方法的干扰,结果表明,葡萄糖、阿拉伯糖、D 葡萄糖酸前体等对CTAB浊度法没有干扰,但Mg2+等具有较为明显的干扰。通过冰乙醇沉淀与改良CTAB浊度法的耦合,实现了发酵液中HA含量的高效测定。     

利用基因工程菌VG1(pTU14)产聚β-羟基丁酸酯的研究

本文对透明颤菌血红蛋白基因 (vgb)和λ噬菌体裂解基因 (S RRz)在不同宿主大肠杆菌中的外源表达及其在聚β 羟基丁酸酯 (PHB)生产中的应用进行了研究。实验结果表明 ,同时携带vgb、S RRz和 phbCAB三种基因的产PHB基因工程菌VG1 ( pTU1 4) ,经过 82h的摇瓶补料分批培养 ,菌体浓度可以高达 2 5 9g/L ,PHB百分含量则可在 52h时达到 95%以上 ;此外 ,该菌株不仅可以实现摇瓶高密度发酵培养和PHB产品的大量积累 ,还可以同时实现菌体细胞的可诱导裂解破壁 ,因此是一株具有潜在工业应用价值的多功能PHB生产菌株。