应用DNA分子标记鉴定黄颡鱼、瓦氏黄颡鱼及其杂交种的研究

为区分黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco Richardson）、瓦氏黄颡鱼（Pelteobagrus vachelli Richardson）及其杂交种，前期研究构建了一个YY超雄黄颡鱼的BAC文库并筛选到了一个包含性别连锁标记Pf62-Y的BAC克隆。研究对该BAC克隆进行测序并鉴定到了一个新基因Inad-like，而且Inad-like的外显子序列在X和Y染色体上基本一致。通过黄颡鱼Inad-like的外显子序列及序列的保守性我们设计引物在瓦氏黄颡鱼中扩增获得了其部分内含子序列。通过内含子序列比对，发现瓦氏黄颡鱼比黄颡鱼少了一个DNA片段。基于黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼的显著遗传差异，设计了一对引物，该引物在黄颡鱼和瓦氏黄颡鱼基因组中分别扩增出1908和1178 bp DNA片段，而且在杂交黄颡鱼中同时扩增出这两个DNA片段。总之，这个新的遗传标记提供了一种稳定、高效识别黄颡鱼及其与瓦氏黄颡鱼杂交种的方法。     

Spindlin在银鲫卵母细胞中磷酸化修饰分析

Spindlin最早在小鼠中被发现和命名,是MOS/MAP激酶通路的底物。实验室之前在银鲫卵母细胞中克隆并分离鉴定出具有同小鼠相似序列特征和表达特性的Spindlin,命名为CagSpin(Carassius auratus gibelio Spindlin)。CagSpin是一个母源表达的蛋白,存在于卵母细胞生长、减数成熟以及早期胚胎发育过程中。研究结合去磷酸化和Western blot分析,检测到CagSpin在卵母细胞中发生磷酸化。进一步通过毛细管电泳(Capillary Electrophoresis,CE)对蛋白水解后的氨基酸残基进行分析,确定在银鲫卵母细胞中CagSpin蛋白的苏氨酸残基(threonine,Thr)被磷酸化,这一结果为CagSpin在卵母细胞中的磷酸化修饰提供了证据,表明磷酸化的CagSpin在银鲫卵子发生、卵母细胞成熟和卵—胚转换中可能起了重要作用。     

中华鲟阿黑皮素原cDNA序列克隆及其序列分析

通过构建中华鲟(Acipenser sinensis)垂体的SMART cDNA质粒文库,首次从文库中筛选得到阿黑皮素原(Proopiomelanocortin,POMC)cDNA全长序列,分别为阿黑皮素原A型基因(Proopiomelanocortin I,AsPOMC-A,EV824935)和阿黑皮素原B型基因(Proopiomelanocortin II,AsPOMC-B,EV825368)。其中,AsPOMC-A和AsPOMC-B分别在文库中出现128次和19次。AsPOMC-A全长1122 bp,有792 bp的开放阅读框,共编码264个氨基酸。AsPOMC-B全长1216 bp,有792 bp的开放阅读框,共编码264个氨基酸。以其氨基酸序列为分子标记,比较了3种鲟鱼的共6种POMC的氨基酸同源性,并利用已报道的鱼类的POMC氨基酸序列构建了系统发育树,可识别2个大的单系类群,即类群I:非新鳍亚纲类群(仅包含辐鳍亚纲的长吻雀鳝),类群II:新鳍亚纲类群。AsPOMC可能是一种进化上更原始的基因。     

银鲫3个肌球蛋白轻链基因cDNA的克隆与特征分析

银鲫 (Carassiusauratusgibelio) ,因具有雌核发育的生殖能力而其天然群体中又存在一定比例 (约 5 %— 2 0 % )的雄性个体[1 ] ,被认为是进行进化遗传和个体发育调控研究的独特模型动物[2 ] 。最近 ,确凿的分子标记证据表明 ,银鲫同时具有雌核发育和两性生殖的能力[3— 6 ] 。银鲫两种不同的生殖方式意味着其卵子中存在微妙的调控体系 ,隐含有控制两性生殖与雌核生殖的关键因子。为了揭示这些因子及其调控机制 ,采用抑制差减杂交技术 ,先后构建了银鲫卵子与其两性近亲物种彩鲫卵子的差减cDNA文库[7] 、银鲫胚胎发育不同阶段的差减cDNA文…     

鲢两个人工雌核发育家系的RAPD分析

鲢 (HypophthalmichthysmolitrixCuriaetValenciennes)为我国著名的四大家鱼之一 ,由于其滤食浮游植物 ,可以有效地降低富营养化水体中浮游生物的含量 ,因而除了单养外 ,也大量应用于池塘混养 ,对水产业有着巨大的贡献 ,在淡水养殖业及淡水捕捞业中一直占有重要的经济地位[1,2 ] 。但由于鲢繁殖周期较长 ,尚未进行长期的选育工作 ,在许多人工繁殖种群中已出现了日益严重的经济性状衰退现象[3 ] 。因此 ,寻求行之有效的选育方案 ,了解其遗传背景及其可供选育参照的遗传标记 ,是鲢遗传选育研究的重要突破口。杨书婷等曾采用基因组操作技术 ,…     

斜带石斑鱼囊胚期胚胎和尾芽期胚胎差异表达基因的筛选及克隆

以斜带石斑鱼囊胚期胚胎和尾芽期胚胎分别作为检验组和驱动组,构建了石斑鱼囊胚期胚胎和尾芽期胚胎的抑制性差减杂交cDNA文库。以α-tubulin作为检测指标,显示差减效率分别高达28和27。分别取囊胚期胚胎和尾芽期胚胎各192和960个PCR阳性克隆进行斑点杂交,得到15个囊胚期和131个尾芽期的斑点杂交阳性克隆。测序和数据库比对分析表明,囊胚期15个阳性克隆中有11个已知基因的cDNA片段和没有同源性的4个cDNA片段;而在尾芽期的131个阳性克隆中,有123个已知基因的cDNA片段和8个没有同源性的cD-NA片段。用半定量RT-PCR技术分析了部分基因片段在胚胎发育过程中的表达规律和和组织分布情况。这些差异表达片段的呈现为进一步揭示石斑鱼胚胎发育、早期性别决定和性腺分化的分子机制奠定了基础。     

黄鳝性腺自然逆转过程中vasa基因的表达分析

本研究采用RNA反义探针原位杂交技术,对vasa基因在黄鳝(Monopterusalbus)性腺发育过程中的表达情况进行了分析。结果表明:vasamRNA在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期卵母细胞的胞质中均匀分布,在Ⅳ、Ⅴ期卵母细胞中vasamRNA有向胞质外周皮层迁移集中的趋势,但不明显;退化的卵粒也呈现vasamRNA阳性反应;在Ⅲ、Ⅳ期卵巢的被膜中检测到带有vasa阳性信号的细胞,这些细胞可能是待向精原细胞分化、迁移到卵巢被膜上的原始生殖细胞(Primordialgermcell,PGC),在性逆转过程中这些PGC可能由卵巢被膜迁移到精小叶中并发育成精子;在成熟精巢中,vasa在精原细胞和初级精母细胞中表达。进一步采用碱性磷酸酶染色法分析黄鳝卵巢及精巢后发现:在卵巢中,除了卵母细胞外,卵巢被膜中也检测到了带有碱性磷酸酶阳性信号的细胞;在成熟精巢中,只在生殖腺囊内的雄性生殖细胞中检测到碱性磷酸酶,而精巢被膜中没有检测到带有碱性磷酸酶阳性信号的细胞。本研究结果初步表明:黄鳝的雄性生殖细胞可能起源于雌性阶段卵巢被膜中的原始生殖细胞[动物学报51(3):469-475,2005]。     

银鲫种系细胞标记分子Vasa: cDNA克隆及其抗体制备

种系细胞始自胚胎发育早期,是动物生殖及生殖工程的基础。为研究鱼类的种系细胞提供标记分子,我们克隆并鉴定了银鲫的vasacDNA即Cagvasa。CagvasacDNA全长2771碱基(nt),编码的蛋白为银鲫Vasa即CagVasa,全长701个氨基酸(aa)。CagVasa蛋白与已知Vasa蛋白的结构特征一致:在N端有14个RGG重复序列,在C端Vasa所特有的8个功能域俱全。银鲫Vasa与鲤鱼、斑马鱼、陆生脊椎动物和果蝇的Vasa蛋白分别有95%,89%,61%-66%和50%的同源性。卵巢切片的RNA原位杂交揭示,Cagvasa限于种系细胞,且表达水平呈现出低-高-低的动态变化:即两头低(卵原细胞跟Ⅳ期成熟卵子),中间高(Ⅱ-Ⅲ期卵子)。为分析鱼类种系细胞提供手段,我们用310aa的N端序列产生细菌的重组蛋白来免疫大白兔,获得了抗Vasa的多克隆抗体αVasa。Western免疫印迹表明,αVasa特异性地识别一个鱼类性腺的蛋白,该蛋白的分子量为75kD,仅见于银鲫的性腺和卵子。卵巢切片的组织免疫荧光共聚焦显微分析表明,抗体αVasa只对种系细胞染色:卵原细胞着色最深,卵母细胞和早期的卵子都浓染,成熟卵则浅染。类似情况亦见之于精子发生早期阶段的雄性种系细胞。卵巢和精巢的体细胞则不着色。因此,Cagvasa编码的当是Vasa同源蛋白,为银鲫种系细胞的第一个标记分子。我们的研究表明,抗体αVasa染色灵敏度高,特异性好,当是鉴别银鲫及其它鲤科鱼类的种系细胞的有效手段     

动物眼睛的起源与进化研究进展

动物眼睛的起源与进化过程是人类在探索自然奥秘过程中遇到的一个非常有趣且引人注目的研究热点,目前这方面的研究已取得了丰硕的成果。从眼睛出现的过程、眼睛进化所需的时间、眼睛的单起源论、眼睛的类型与进化、光感受器与眼睛进化的关系、光感受器和视蛋白的类型与进化这6个方面简要概述了动物眼睛起源与进化的主要研究进展。     

双链RNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞差减cDNA文库的构建

以紫外线灭活的dsRNA病毒草鱼出血病病毒(GCHV)诱导和模拟诱导的牙鲆胚胎细胞为材料,利用抑制性差减杂交(SSH)技术,成功构建了双链RNA病毒诱导的牙鲆胚胎细胞(FEC)差减cDNA文库.以管家基因α-tublin作为差减指标,经检测,该文库差减效率达2 10倍,表明经病毒诱导后某些差异表达基因也得到了相应倍数的富集.将获得的cDNA片段连接到pGEM-T载体,PCR检测显示差减片段在250bp～2 000bp之间.该差减cDNA文库的构建为从分子水平研究牙鲆培养细胞对dsRNA病毒的免疫反应、以及进一步鉴定和克隆差异表达基因打下了坚实基础.