地中海拟无枝菌酸菌U-32硝酸还原酶的基因克隆

outhern杂交分析表明在地中海拟无枝菌酸菌u－32染色体DNA和黑曲霉niaD(硝酸还原酶基因)之间存在着明显的同源性。利用异源niaD探针从地中海拟无枝菌酸菌u－32基因文库中筛选得到一个能与niaD杂交的5.0kb的Pst Ⅰ片段。该片段经同位素标记后能与地中海拟无枝菌酸菌u－32染色体上一个相同的Pst Ⅰ片段杂交,位于这一片段上的2．1kb sma Ⅰ—EcoR Ⅴ片段只能与以硝酸盐为唯一氮源的总RNA杂交,而不能与相同条件下以铵盐为唯一氮源的总RNA杂交,这些结果表明,所克隆到的5,0kb Pst Ⅰ DNA片段含有地中海拟无枝菌酸菌U-3z的硝酸还原酶基因。这是好氧细菌硝酸还原酶基因克隆的首次报道。由该酶蛋白分子量推测,其结构基因大小在1．5kb左右,进一步的杂交分析发现在5．0kb的Pstl片段中含有完整的NR基因。用20种限制酶对重组质粒pJLl进行了限制酶酶谱的构建。发现有10种酶在pJLl外源片段上无切点,6种酶为单切点,EcoR Ⅰ与Sma Ⅰ各有两个切点。     

转座子Tn4、Tn3与Tn233(CH)之间转座功能互补与转座免疫的研究

Tn4(sm~rSu~rAp~r)、Tn3(Ap~r)与Tn233(CH)(Sm~rSu~rHg~r)是结构上相关而且都属于TnA家族的转座子。据报道Tn4中还含有一个拷贝的Tn3。为了弄清它们在家系中的关系,我们进行了Tn4、Tn3与Tn233(CH)之间的转座功能互补与转座免疫的研究。结果如下:(1)当Tn4以反式状态存在时,Tn233(CH)转座功能缺失的tnpA~-变种(Ta233△E12)的转座能力可以恢复,但Tn3不能使之恢复;(2)Tn233(CH)能转座到质粒R144drd3::Tn4或R144drd3::Tn3上形成带二个转座子的质粒;(3)带二个转座子的质粒会失去二种不同转座子中的一种。当寄主细胞在无抗生素的营养培养基上移种5—15次后,仍带有二种转座子共存质粒R144drd3::Tn233::△E15::Tn233△B5的细胞的百分率只有8.3％;与此相比,在相同的情况下,带R144drd3::Tn4::Tn233(CH)的细胞的百分率为71.2—86.2％,带R144drd3::Tn3::Tn233(CH)的细胞的百分率为96.2％。     

以技术集成促进生物催化技术转移

生物催化研究和产业化都在迅速发展,但两者之间的联系并不紧密,成功的技术转移很少。缺乏集成研发平台成为生物催化技术转移的瓶颈。在国内相关企业的技术力量不足以进行技术集成的现状下,建议中国科学院建设酶工程集成研发平台,依托此平台企业和科研院所建立广泛的技术合作和技术转移关系,建立生物催化产业的产学研价值链。     

GL－7－ACA酰化酶基因克隆及在大肠杆菌中的表达

本文报道了利用BamHⅠ酶解的载体pBR322 DNA与Sau3A部分酶解的假单胞菌Ps．130染色体DNA片段构建重组质粒,并用³²P标记的寡核苷酸探针从3205个含有外源片段的重组质粒中检测得到7株阳性克隆株。进一步经¹²⁵Ⅰ标记的抗体／抗原放射免疫反应、GL－7－ACA酰化酶活力测定以及酶反应产物的纸谱色层分析,由上述7株阳性株中鉴定出3株能在大肠杆菌中表达酰化酶活力的基因克隆株。对该3株菌的重组质粒——pMR 5、pMR 6和pMR-7-DNA的初步凝胶电泳分析表明,pMR 5和pMR 7质粒中插入片段的分子量为6．8kb,质粒pMR 6则带有5．7kb的外源片段。实验还比较了重组质粒pMR 5在8株不同的大肠杆菌宿主菌中,GL－7－ACA酰化酶的表达水平。     

GL-7-ACA酰化酶的分离纯化及性质研究

CU334是高表达GL-7-ACA酰化酶工程菌,其菌悬液用超声波处理后,经硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sephadex A-50离子交换柱层析、DEAE—纤维素DE-52柱层析、Sephadex G-200凝胶过滤及羟基磷灰石吸附柱层析等步骤,得到了凝胶电泳均一的GL-7-ACA酰化酶蛋白,纯化了22倍,得率4.0％,比活力为13.8U/mg。用浓度梯度PAGE测得GL-7-ACA酰化酶的分子量为134kD,用SDS-PAGE测得两个亚基分子量分别为15.5kD和58.4kD。用PI法测得等电点为3.5。GL-7-ACA酰化酶反应最适pH为7.0。反应最适温度为37℃,GL-7-ACA酰化酶对底物GL-7-ACA的K_m值为0.50mmol/L,V_(max)为13.10U·mg~(-1)。Ca²⁺、EDTA和巯基乙醇对该酶有激活作用,Cu²⁺、Fe²⁺和Mg²⁺等有一定程度的抑制作用。产物7-ACA、戊二酸均为GL-7-ACA酰化酶的反竞争性抑制剂,其K_1值分别为16.58mmol·L~(-1)和9.88mmol·L~(-1)。     

GL—7ACA酰化酶（C130）β亚基N端氨基酸残基的突变及功能

戊二酰 7 氨基头孢烷酸酰化酶 (即GL 7ACA酰化酶 ,EC .3.5 .1.11)的催化中心通常在 β亚基N端的第一个氨基酸 ,底物亲和标记的研究亦显示N端存在着结合靶点 ,因而该区域的结构可能与酶的功能密切相关。对C130 β亚基N端的 2～ 8位氨基酸残基分别进行了肽段置换和定点突变研究。将N端前 8位肽段置换为来源于Arthrobacterviscosus的青霉素G酰化酶 (PAC)的对应序列后 ,C130酰化酶活力丧失 ;而置换为来源于E .coli的青霉素G酰化酶 (PGA)的对应序列后 ,酰化酶活力仍然保留 ,但Km 值从 0 .44× 10 -3 mol·L-1增大为 0 .5 5× 10 -3mol·L-1,kcat值由 4.92s-1降低为 1.6 4s-1。另对C130 β亚基N端 2～ 4位氨基酸残基作了单点突变 :第 4位的Trp为可能的底物类似物结合位点 ,被变为Tyr后 ,它对底物GL 7ACA的结合能力略为减弱 ,kcat则降低为 2 .2 9s-1;而变为Leu后 ,Km 为 0 .34× 10 -3 mol·L-1,kcat为 3.15s-1;第 3位的Ser变为Met、Ala及Cys后 ,随着Km值逐渐降低 ,kcat也有所降低 ,而S3 M、S3 A突变体的kcat/Km 值比野生型的分别增加了 2 2 .3%和 39.3% ;将活性中心Ser(β1)邻位的Asn(β2 )变为Gln后 ,C130酶活大幅度下降 ,kcat减为 0 .47s-1。上述结果表明 ,C130 β亚基N端的前几个氨基酸残基均可对酶的功能     

三角酵母整细胞酶促转化头孢菌素C为戊二酰-7-氨基头孢烷酸

研究了利用含D-氨基酸氧化酶(Damino acid oxidase, DAO EC1.4.3.3)的透性化三角酵母多倍体FA10(Trigonopsis variabilis FA10)细胞酶促转化头孢菌素(Ccephalosporin> C, CPC)为戊二酰-7-氨基头孢烷酸(Glutaryl-7-ACA,GL-7-ACA)的反应过程和细胞中同时存在的过氧化氢酶(Catalase, CAT)通过水解H₂O₂而对转化反应产生的干扰作用及其对策。实验证明适量添加外源H₂O₂(6%)或在反应体系中加入过氧化氢酶抑制剂NaN₃(0.13mg/mL)可使GL-7-ACA生成率分别为73.0%和70.1%。如果将透性化的FA10细胞在pH10.5～11.0,20℃条件下保温30min,CAT被不可逆性完全钝化,以无过氧化氢酶的FA10细胞进行CPC的酶促转化反应,GL-7ACA的生成率可达84%。     

Burkholderia pickettii中D-乙内酰脲酶基因(dha)的克隆、测序及表达

对一株能转化D,L-对羟基苯乙内酰脲为D-对羟基苯甘氨酸的菌株MMR003进行了细菌分类学鉴定,该菌为皮氏伯克霍尔德氏菌(Burkholderia pickettii)。实验通过Southern杂交,部分文库构建和筛选,并经一系列亚克隆测序分析,获得一长度为1374bp的完整开放阅读框,编码458个氨基酸的D-乙内酰脲酶基因。用该基因序列构建的高表达质粒pXZPH2转化E.coliBL21(DE3),经IPTG诱导后,检测到D-乙内酰脲酶活性。该基因编码的氨基酸序列经Blast同源比较分析与放射形土壤杆菌NRRL B11291所产相应酶有85%的同源性。以D,L-对羟基苯乙内酰脲为底物测得的表达酶的活力为0.66u/mL,比相同条件下所测出发菌株MMR003的酶活提高了2倍。     

生物丁醇制造技术现状和展望

丁醇是大宗基础化工原料,并有望成为新一代生物燃料。利用可再生原料通过微生物发酵生产丁醇受到人们的很大关注。然而,与石油原料制造丁醇相比,目前生物丁醇的制造成本偏高。生物丁醇制造技术按重要性排序:在廉价原料替代、低丁醇浓度及存在丙酮、乙醇低值副产物3个方面有改进空间。上海生物丁醇协作组设定了由易到难的技术路线图:通过代谢工程提高丁醇比例;在丁醇高耐受菌株中导入和优化丁醇合成途径;去除葡萄糖阻遏效应使之可利用复杂原料。协作组相信,通过与国内外广泛的产学研合作,应可在不远的将来开发出有经济竞争力并可持续发展的生物丁醇生产工艺。