CRISPR/Cas9介导的外源基因靶向插入鸡EAV-HP基因组

本研究旨在通过CRISPR/Cas9介导外源基因靶向插入鸡EAV-HP基因组。首先设计特异性引物并扩增鸡内源性病毒(EAV-HP)左右同源臂和增强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因表达盒,然后通过重叠延伸PCR技术将两个同源臂DNA连接至eGFP表达盒两侧,获得全长DNA片段LER,并克隆至pMD19-T载体,获得携带eGFP基因的供体载体pMDT-LER。随后在HEK293T细胞中验证供体载体pMDT-LER能成功表达eGFP后,将EAV-HP打靶载体和供体载体共转染至DF-1细胞,观察绿色荧光阳性细胞,提取细胞基因组,PCR检测外源基因eGFP成功整合至鸡基因组EAV-HP位点。最后,将转基因细胞DF-1传至第7代,用PCR和Western blotting检测eGFP在转基因细胞中稳定表达。文中初步验证外源基因eGFP能整合至鸡EAV-HP位点并稳定表达,为转基因鸡的研究提供新整合位点。     

略阳乌鸡内源性逆转录病毒鉴定及表达分析

内源性禽白血病病毒等以多种逆转录病毒基因组稳定存在鸡染色体中,其致病性低或无致病性,但是内源性病毒的基因表达降低了鸡抵抗外源病毒感染的能力。本研究以略阳乌鸡为研究对象,利用多重PCR鉴定鸡基因组中禽内源性病毒EAV-HP和禽白血病病毒E亚群(ALV-E),分析ALV-E的env基因表达情况。结果表明,30只略阳乌鸡的基因组中均携带EAV-HP病毒序列,其中28只携带ALV-E序列。通过MEGA和NETWORK软件对ALV-E的gp85基因分析表明,略阳乌鸡与江苏绿壳蛋鸡聚在同一分支,两者同源性高达99.1%。此研究也为后续略阳乌鸡遗传背景分析和选育抗病毒感染优良品种提供基础数据。