新型RNAi 载体抑制HPV16E6 基因在人宫颈癌细胞Caski 中的表达

目的:利用自行构建的一种基于Semliki森林病毒的新型RNAi载体pSFV-RNAi Ready,验证将其用于短期高效沉默HPV16E6基因的效果。方法:以HPV16E6为靶标基因,设计并构建基于pSFV-RNAi Ready的重组质粒,分直接电击转染和病毒颗粒共培养两种方式转入人宫颈癌细胞株Caski,RT-PCR、Western blot检测HPV16E6表达水平。结果:重组质粒对HPV16E6沉默效果优于常规RNAi质料载体,接近化学合成小RNA,抑制率可高达90%以上,10天后效果仍然存在;结论:新型RNAi载体pSFV-RNAi Ready可较好地应用于特异高丰度靶基因的表达抑制,有望用于未来的科学研究或治疗应用。     

植物核仁小分子RNA的研究进展

20世纪60年代末Weinberg等在哺乳动物中发现了第一个核仁小分子RNA(small nucleolar RNA,snoRNA)U3,在这一领域的研究特别是在20世纪90年代以来,陆续发现许多新的核仁小分子RNA。近几年对动物、酵母和植物方面snoRNA的研究进展,使人们大大地加深了对于rRNA加工和转录以及一系列生物调控过程和机制的认识,正如Smith和Steitz所说的那样：“核仁中sno风暴”引起生物界极大的震动。本文重点介绍植物snoRNA的研究。     

新型RNAi载体抑制HPV16E6基因在人宫颈癌细胞Caski中的表达

目的：利用自行构建的一种基于Semliki森林病毒的新型RNAi载体pSFV-RNAi Ready,验证将其用于短期高效沉默HPV16E6基因的效果。方法：以HPV16E6为靶标基因,设计并构建基于pSFV-RNAi Ready的重组质粒,分直接电击转染和病毒颗粒共培养两种方式转入人宫颈癌细胞株Caski,RT-PCR、Western blot检测HPV16E6表达水平。结果：重组质粒对HPV16E6沉默效果优于常规RNAi质料载体,接近化学合成小RNA,抑制率可高达90%以上,10天后效果仍然存在;结论：新型RNAi载体pSFV-RNAi Ready可较好地应用于特异高丰度靶基因的表达抑制,有望用于未来的科学研究或治疗应用。     

基于深圳男男同性性行为人群的HIV-1广谱中和抗体筛选分析

目的:筛选基于深圳本地男男同性性行为者(Men who have sex with men,MSM)人群队列中HIV-1流行毒株的广谱中和抗体(Broadly neutralizing antibodies,bn Abs),为下一步机制和应用研究奠定基础。方法:建立小型MSM队列,按计划分别定期随访、留样,测序分析人群中HIV-1病毒流行亚型。选取将骨架质粒与系列标准HIV-1 env质粒12款,分别共转染293细胞制备单次感染能力假病毒。建立TZM-bl细胞实验测定并计算中和活性(ID50Titers)技术平台,用于选定病毒亚型样品的筛选。最后取所获具有一定广谱中和抗性的代表性血样,通过抗体竞争实验初步分析其结合位点。结果:近年来,深圳MSM的HIV-1流行亚型分布中,CRF07_BC(43.4%)和CRF55_01B(15.4%)占比快速增长。选择来自该人群队列CRF07_BC感染者34人88份血样进行广谱中和抗性检测,筛选出具有一定广谱中和抗性的血样10份(ID50 Titer≧25),其中2例显示了较佳中和宽度,可作用于全部12种假病毒中的7种(58.3%)。初步分析其结合机制均非靶向gp120。结论:本研究成功建立小型MSM队列和TZM-bl检测分析技术并应用于实践,初步筛选结果提示部分具有中和活性的患者血清内存在bn Abs。     

基于Semliki森林病毒复制子的新型RNAi质粒载体的构建

目的:以semliki森林病毒复制子为基础,构建一类可迅速高效表达shRNA的新型RNAi载体。方法:以Semliki森林病毒衍生的复制子载体pSFV1为骨架,用CMV IE启动子替换SP6启动子并在3′-UTR下游插入SV40 polyA转录终止子,在原26S亚基因组启动子后插入带有相应改良多克隆位点的shRNA表达元件,同时加入抗新霉素选择复合体,并去掉3′-UTR的重复序列。所获载体用于沉默EGFP基因,通过体外细胞转染、病毒颗粒制备、荧光显微镜观察、RT-PCR分析等初步验证、评估其效果。结果:构建了基于Semliki森林病毒复制子的新型RNAi质粒载体pSFV-RNAi Ready。经体外实验初步证实,该载体直接转染细胞,或与辅助载体共转染,制备成具有感染能力的重组病毒颗粒后使用,均可高水平表达shRNA,沉默目的基因。其中使用病毒颗粒抑抑效率可高达90%以上。结论:该载体的成功构建,可望显著拓宽SFV载体的应用范围,丰富RNAi实施手段,并用于相关科学研究及基因药物技术开发。