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非同源末端连接(nonhomologous end joining,NHEJ)是动物基因组DNA双链断裂(double-strand break,DSB)修复的优选途径,通过与同源重组(homologous recombination,HR)竞争DSB靶点,进而抑制HR的效率。为提高HR效率,本研究针对猪NHEJ通路修复关键因子PNKP、LIG4和NHEJ1的编码序列,设计并合成相应的靶向小干扰RNA(small interfering RNA,si RNA),组成若干对RNAi(RNA interference)系统,将RNAi系统与报告质粒SSA-GFP reporter、HDR-GFP system和ss ODN-GFP system共转染至猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts,PFFs),检测敲低上述NHEJ关键修复因子后对HR的影响。RNAi结果显示,针对PNKP、LIG4和NHEJ1设计的si RNA均可显著敲低PNKP、LIG4和NHEJ1基因的表达(P0.05)。选择干扰效果最好的si RNA与报告载体共转染PFFs,结果表明干扰PNKP基因表达后可显著提高单链退火(single strand annealing,SSA)修复效率、双链或单链DNA介导的同源重组定向修复(homology-directed repair,HDR)效率分别为55.7%、37.4%和73.1%(P0.05),而干扰LIG4和NHEJ1分别提高双链和单链介导的HDR效率为37.5%和76.9%(P0.05)。  相似文献   
2.
神经生长因子(Nerve growth factor,NGF)是一种能促进神经元发育、分化、再生的蛋白。为高效生产药效更佳的人源NGF (hNGF)药物,最近,笔者实验室构建出唾液腺特异表达hNGF的转基因小鼠,并从该转基因小鼠唾液中纯化获得具有高生物学活性的h NGF蛋白。为了选择性别和日龄最适宜的转hNGF基因小鼠用于收集纯化hNGF蛋白,文中比较了28日龄(性成熟前)雄性、雌性,63日龄(性成熟后)雄性、雌性转hNGF基因小鼠,共4组转hNGF基因小鼠分泌的唾液量、唾液总蛋白量、唾液鼠源NGF (mNGF)蛋白量和唾液h NGF蛋白量等指标。结果显示,63日龄的转hNGF基因小鼠分泌的唾液量、唾液总蛋白量、唾液mNGF蛋白量和唾液hNGF蛋白量显著高于28日龄同一性别的转hNGF基因小鼠,且63日龄的雄性转hNGF基因小鼠分泌的唾液hNGF蛋白量显著高于同一日龄的雌性转hNGF基因小鼠;在4组小鼠中,63日龄的雄性转hNGF基因小鼠分泌的唾液hNGF含量最高,比28日龄雌性转hNGF基因小鼠高出约46倍,最适宜用于收集唾液并从中纯化hNGF。  相似文献   
3.
成簇的规律间隔的短回文重复序列(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats,CRISPR)/CRISPR相关蛋白(CRISPR-associatedproteins,Cas)系统是目前基因编辑、基因表达研究的热点,其中靶向RNA的CRISPR/Cas13系统的开发为RNA的干扰和编辑提供了新的方向。文中针对HEK293T细胞非同源末端连接(Nonhomologousendjoining,NHEJ)通路修复关键因子Ku70和Lig4的编码序列,设计并合成CRISPR/Cas13a、b系统相应的gRNA,检测其对ku70和lig4基因表达的影响。结果显示,Cas13a对ku70和lig4的RNA敲减效果可以达到50%以上,Cas13b对ku70和lig4的RNA敲减效果分别达到92%和76%;同时Cas13a、b系统能将Ku70和Lig4蛋白水平分别下调至68%和53%。CRISPR/Cas13系统可有效敲减HEK293T细胞RNA和蛋白质表达,为基因功能和调控研究提供一种新的策略。  相似文献   
4.
基因组DNA发生双链断裂(double strand break, DSB)后主要通过同源定向修复(homologous-directed repair, HDR)和非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ)两种途径进行修复,其中单链寡聚核苷酸(single-stranded oligodeoxyribonucleotide, ssODN)介导的同源定向修复是动物基因组常用的基因组定点修饰技术,具有较大的科研和应用价值。为提高猪基因组ssODN介导HDR效率,本研究以猪胎儿成纤维细胞(porcine fetal fibroblasts, PFFs)为研究对象,利用丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase, MEK)抑制剂PD0325901培养细胞,研究其对HDR效率的影响及作用分子机理。结果显示,PD0325901能显著提高PFFs的G_2期和S期细胞群百分比,减少G_1期细胞群比率,促进HDR修复因子的表达。在最适浓度250 nmol/L时,PD0325901使ssODN介导的GFP报告载体的修复效率提高了58.8%;同时使PFFs基因组位点DMD和ROSA26定点修饰效率分别提高了48.16%和17.64%。本研究表明,MEK抑制剂PD0325901能显著提高猪基因组ssODN介导的同源定向修复效率,为高效制备定点基因修饰动物模型提供了新思路。  相似文献   
5.
组蛋白甲基化是发生在核小体核心组蛋白各亚基N-端肽链的一种修饰方式。在组成核小体的4种亚基中,H3亚基N-端肽链第4、9、27、36和79等位点的赖氨酸为甲基化热点,甲基化类型包括一、二、三甲基化(mono-, di-, tri-methylation)。H3K27me3是发生在组蛋白H3亚基第27位赖氨酸的三甲基化,主要发挥转录抑制的作用,参与骨骼肌的发育调控。研究表明,H3K27me3能够与骨骼肌增殖和分化的关键转录因子(如MyoD和MyoG等)及细胞周期蛋白特异性结合,并与其他表观遗传调控因子lncRNA及miRNA等互作,对骨骼肌的增殖和分化时间以及程度进行精细调控。本文系统介绍了组蛋白甲基化的类型以及H3K27甲基化和去甲基化的生物学过程,总结了目前已报道的H3K27me3在骨骼肌成肌细胞增殖和分化过程中发挥的作用,以期辅助科研工作者了解H3K27me3在骨骼肌发育过程中的作用,以及为进一步提高哺乳动物肌肉品质提供参考。  相似文献   
6.
组蛋白异常修饰是克隆胚胎发育的重要制约因素,组蛋白H3K9me3去甲基化酶KDM4家族的过表达可以有效提高克隆胚胎的发育效率。为探究过表达H3K9me3去甲基化酶对猪克隆胚胎发育的影响,本研究在猪克隆胚胎1-细胞期和2-细胞期分别注射KDM4A mRNA和KDM4D mRNA检测胚胎的囊胚率;收集1-细胞期注射KDM4A mRNA和胚胎注射水(对照组)的2-细胞期克隆胚胎检测H3K9me3表达水平;此外,收集1-细胞期注射KDM4A mRNA和胚胎注射水的4-细胞期克隆胚胎进行单细胞转录组测序,并对测序数据进行GO与KEGG富集分析。结果显示:在1-细胞期注射KDM4A mRNA的猪克隆胚胎囊胚率显著高于对照组(25.32±0.74%vs14.78±0.87%),注射KDM4D mRNA对猪克隆胚胎囊胚率无明显作用(16.27±0.77%vs 14.78±0.87%);在2-细胞期注射KDM4A mRNA和KDM4D mRNA的克隆胚胎囊胚率与对照组相比均无显著差异(32.18±1.67%、30.04±0.91%vs 31.22±1.40%)。在1-细胞期注射KDM4A mRNA的克隆...  相似文献   
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