胸腺肽α1-Spl DnaX内含肽融合蛋白的切割动力学研究

目的:研究胸腺肽α1(Tα1)与Spl DnaX内含肽融合蛋白AS的体外切割动力学。方法:构建Tα1和SplDnaX内含肽的融合表达载体pET-AS,转化大肠杆菌BL21(DE3),经乳糖诱导获得可溶性表达的融合蛋白AS,用镍亲和层析纯化该蛋白;综合评价温度、β-巯基乙醇(β-ME)浓度和诱导切割时间对Spl DnaX内含肽介导融合蛋白AS自切割释放Tα1的影响。结果:在大肠杆菌中诱导表达了融合蛋白AS,经镍柱纯化获得该蛋白;随着温度升高和β-ME浓度增加,诱导切割时间延长,Spl DnaX内含肽介导的切割率逐渐增大;最终采用300 mmol/Lβ-ME切割24 h,融合蛋白的硫解切割率大于90%。结论:通过对Spl DnaX内含肽的诱导切割条件进行摸索,确定了最适宜的切割条件,为利用该方法制备Tα1和其他小分子多肽提供了技术基础。     

rimJ基因缺失不影响大肠杆菌BL21(DE3)生长的温度敏感性

目的:研究rimJ基因对大肠杆菌BL21(DE3)菌株生长的温度敏感性的影响。方法:利用SceⅠ-Red同源重组技术将大肠杆菌BL21(DE3)基因组中的rimJ基因缺失,得到rimJ缺失突变菌;比较缺失突变株和原始菌株在不同温度(25℃、37℃、42℃)下的最大比生长速率,利用统计学方法分析rimJ基因的缺失对BL21(DE3)菌株生长的温度敏感性是否有影响。结果:rimJ基因被成功敲除;统计分析结果表明缺失突变株和原始菌株的最大比生长速率没有明显区别。结论:rimJ基因缺失对大肠杆菌BL21(DE3)生长的温度敏感性无影响。     

稳定同位素标签技术在定量蛋白质组研究的应用

高通量的从蛋白质组水平进行整体的蛋白质鉴定和精确定量比较分析,在阐述生物功能以及疾病发生发展机制等方面非常重要。稳定同位素标签技术在过去的几年中获得了很大的发展,并形成了代谢引入类、化学合成类以及酶解引入类等三大类型。该文对稳定同位素标签技术的技术特点以及应用进行了简述。     

胸腺素α1的乙酰化修饰不依赖于乙酰转移酶RimL

目的：考察大肠杆菌乙酰转移酶RimL对胸腺素α1（Tα1）乙酰化修饰的影响。方法：构建含500bp同源臂的卡那抗性基因打靶片段,利用Red同源重组系统,使大肠杆菌B121（DE3）的rimL基因插入失活,随后导入质粒pCP20去除抗性基因,构建突变菌株rimL-BL21（DE3）;将重组质粒pET-Tα1-L12分别转入出发菌株和突变菌株中进行表达,经固定金属离子亲和层析和反向高效液相层析后,将所得纯品进行质谱分析,精确测定相对分子质量。结果：PCR鉴定结果证明成功敲除rimL基因;质谱结果表明,rimL基因敲除菌中所表达的Tα1-L12融合蛋白与出发菌株一样,均有部分乙酰化修饰。结论：Tα1的乙酰化修饰并不依赖于RimL。     

通过染色体整合表达古菌乙酰化酶合成N-末端乙酰化胸腺肽β4

胸腺肽β4（Tβ4）是N-末端乙酰化的43肽,具有多种重要生物学功能.其生物合成存在两大难点,即乙酰化修饰和小分子肽的表达.本研究发现来自古菌Sulfolobus solfataricus的乙酰化酶ssArd1可以催化Tβ4的N-末端乙酰化修饰.利用Red同源重组技术将ssArd1基因表达盒整合至E.coli BL21（DE3）染色体的lpxM位点上,构建了可以实现Tβ4N-末端乙酰化修饰的新型宿主E.coli BDA.将Tβ4编码基因融合在改造的微型Spl DnaX Intein的N端,并在Intein的C端添加His标签,构建了表达载体pET-Tβ4-Intein.在E.coli BDA中表达的融合蛋白,经镍亲和层析纯化后用β-巯基乙醇诱导融合蛋白切割释放小分子多肽,获得了具有N-末端乙酰化的Tβ4.     

通过一种新方法使T7基因Ⅰ置换araBAD基因簇

目的：用T7RNA聚合酶基因T7基因Ⅰ置换大肠杆菌基因组中的araBAD基因簇。方法：通过分析大肠杆菌基因组中araBAD基因序列,设计两侧同源臂,构建高拷贝数的打靶质粒,并且在这个质粒上的打靶片段两侧各加上一个归巢内切酶位点;将辅助质粒和打靶质粒同时转化到宿主体内,在L-阿拉伯糖的诱导下表达归巢内切酶和Red重组酶,实现体内重组,使T7基因I置换araBAD基因簇。结果：在4株不同的大肠杆菌中用T7基因I置换了araBAD基因簇。结论：成功地将T7基因Ⅰ整合到araBAD基因位置,为构建PAra-PT7表达系统奠定了基础。     

通过一种新方法使T7基因I置换araBAD基因簇

目的:用T7 RNA聚合酶基因T17基因I置换大肠杆菌基因组中的araBAD基因簇.方法:通过分析大肠杆菌基因组中araBAD基因序列,设计两侧同源臂,构建高拷贝数的打靶质粒,并且在这个质粒上的打靶片段两侧各加上一个归巢内切酶位点;将辅助质粒和打靶质粒同时转化到宿主体内,在L-阿拉伯糖的诱导下表达归巢内切酶和Red重组酶,实现体内重组,使T7基因I置换araBAD基因簇.结果:在4株不同的大肠杆菌中用T7基因I置换了araBAD基因簇.结论:成功地将T7基因,整合到araBAD基因位置,为构建Para-PT7表达系统奠定了基础.     

乙肝纤维化分级相关血浆蛋白标志物的定量蛋白质组筛选

非创伤性肝纤维化检测对于评价肝炎进程、临床治疗以及药效评价等方面,都具有非常重要的作用.通过N末端标签的蛋白质组定量手段,从血浆中筛选肝纤维化分级相关的蛋白候选标志物.首先利用目前纤维化诊断黄金标准——肝穿病理检测,获得纤维化不同分级的合格样本血浆,并对肝纤维化各级间的血浆混合样本进行了蛋白质组定量比较分析,发现了72个与乙肝纤维化分级呈明显相关性的血浆蛋白,构成了一个有重要参考价值的、纤维化分级诊断的候选蛋白标志物库.用WB法进一步验证了定量结果的准确性.利用IPA在线分析后获得了4个生理代谢网络图,提示这些差异蛋白在肝纤维化进程中代表的不同功能影响.总之,利用N末端标签定量蛋白质组技术,全面定量挖掘了血浆中与乙肝纤维化分级相关的差异蛋白及变化规律,对于加深肝纤维化发病机制的认识和理解具有很大帮助,同时也为肝脏纤维化临床诊断和治疗提供有益信息和参照.     

新型佐剂——鞭毛蛋白及其突变体的原核表达和纯化

目的:改构鞭毛蛋白可变区,并优化目的蛋白表达与纯化参数,为评价并获得新型高效蛋白佐剂奠定基础。方法:以鼠伤寒沙门菌基因组为模板钓取2种鞭毛蛋白FljB和FliC的编码基因,分别构建FljB和FliC及其对应的删除可变区的突变体BNLC和CNLC的表达载体,在大肠杆菌中诱导表达,并纯化目的蛋白。结果与结论:原初鞭毛蛋白FljB和FliC均以胞内可溶形式表达,而改造后的鞭毛蛋白BNLC和CNLC则以包涵体形式表达。通过优化纯化条件,分别建立了针对4种蛋白的纯化方法,得到无热源、纯度大于95%的目的蛋白,为进一步研究鞭毛蛋白的结构与佐剂效应的关系奠定了基础。     

胸腺肤α1-Spl DnaX内含肤融合蛋白的切割动力学研究

目的:研究胸腺肤α1(Tal)与Spl DnaX内含肤融合蛋白AS的体外切割动力学.方法:构建Tαl和SplDnaX内含肤的融合表达载体pET-AS,转化大肠杆菌BL21(DE3),经乳糖诱导获得可溶性表达的融合蛋白AS,用镍亲和层析纯化该蛋白;综合评价温度、β-巯基乙醇(β-ME)浓度和诱导切割时间对Spl DnaX内含肤介导融合蛋白AS自切割释放Tα1的影响.结果:在大肠杆菌中诱导表达了融合蛋白AS,经镍柱纯化获得该蛋白;随着温度升高和β-ME浓度增加,诱导切割时间延长,Spl DnaX内含肤介导的切割率逐渐增大;最终采用300mmol/L β-ME切割24 h,融合蛋白的硫解切割率大于90%.结论:通过对Spl DnaX内含肤的诱导切割条件进行摸索,确定了最适宜的切割条件,为利用该方法制备Tαl和其他小分子多肤提供了技术基础.