Pfu DNA聚合酶的制备过程及其条件优化

聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)可以方便、快捷、准确地大量复制目的基因片段,是分子生物学研究中不可或缺的技术手段。在PCR反应中,DNA聚合酶起着关键作用。Pfu酶(Pfu DNA polymerase)是DNA聚合酶的一种,具有5′→3′聚合酶活性和3′→5′外切核酸酶活性,可在聚合酶链式反应中纠正错误掺入的碱基,可以快速、高保真地扩增DNA片段,在分子克隆和DNA测序当中运用十分广泛。本研究建立了一套Pfu聚合酶表达与纯化的详尽方案,该方案利用异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)作为诱导剂,在大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达Pfu酶,然后利用Ni-NTA柱层析纯化制备。研究中对IPTG诱导时间、细胞破碎条件、缓冲液类型及其p H、粗酶液热处理温度与时间、洗脱液中最佳咪唑浓度等重要条件和参数分别进行了优化确定。实验结果表明,使用该方案可以成功制备高产量高纯度的Pfu聚合酶,完全满足常规PCR反应的要求。本研究建立的实验方法和技术参数,十分适用于研究者小规模自主制备Pfu酶,对于有大量分子克隆要求的课题组,利用该方案自主制备Pfu酶能够显著节省科研成本。     

基于重组酶和终止子的状态调控开关设计

合成生物学研究常用基因开关来调控细胞的状态以实现相应功能。已有的基因开关往往需要持续的输入信号来维持特定的开关状态,开关功能的维持需要持续消耗能量,并且对扰动较为敏感。文中利用了位点特异性重组酶的倒位效应反转终止子,构建了一种转录层次的状态调控开关,使得脉冲信号即可触发开关状态改变,并在下一次信号来临前稳定维持当前状态。应用自下而上的工程化思想,文中先后对重组酶和终止子进行了单独表征和组合表征,探究了二者之间的相互影响,筛选出了相互兼容的组合,成功实现了细胞的单次、二次状态切换。最后,此开关成功地被用于构建生物七段译码器,显示出了其较好的应用潜力。     

芽孢杆菌鞭毛及其运动相关特性的研究进展

鞭毛是着生在很多细菌体表的细长弯曲丝状物,作为细菌的运动“器官”,鞭毛是微生物学中研究最深入的生理系统之一。细菌可以通过鞭毛运动更好地适应栖息环境,并在环境条件不利时及时逃离。此外,鞭毛运动对于有害细菌或者有益细菌在宿主表面的定殖、生物膜形成及其与宿主其他互作过程中都发挥着重要作用。芽孢杆菌(Bacillus sp.)是一类在自然界中广泛分布的细菌,其许多菌株在工农业生产及医药等领域都有重要的应用价值,本文对芽孢杆菌鞭毛及其运动相关特性的研究进展进行了综述：芽孢杆菌鞭毛的结构组成、组装过程及合成基因的表达调控;芽孢杆菌运动性与相关生物学特性,包括生物膜形成和分散、芽孢的形成、感受态形成、γ-聚谷氨酸和抗生素生产等方面之间的相互关系及其底层分子机制。本综述旨在为本领域的相关研究提供可参考的综合知识和理论指导依据。     

植物根际益生细菌代表性菌株贝莱斯芽孢杆菌FZB42对松材线虫的抑杀性

【目的】由松材线虫导致的松树萎蔫病是松树的毁灭性病害,也是我国最主要的林业病害之一。本研究测评了在农业上广泛使用的、我国微生物肥料行业主要菌种资源之一——贝莱斯芽孢杆菌,对松材线虫的潜在抑杀性能。【方法】选用贝莱斯芽孢杆菌的代表性菌株FZB42为材料,测定对不同条件下的菌液上清、不同菌株的菌液上清、细菌素plantazolicin的提取物以及菌体直接接触等方式,对松材线虫死亡率/存活率的影响,并构建FZB42生物膜合成缺损菌株,测定比较其对松材线虫存活率的影响。【结果】相比于Landy培养基,使用LB培养基得到的菌液上清,对松材线虫具有明显抑杀性,培养48h的菌液上清比培养24h的菌液上清抑杀性更强,同时,菌液上清的抑杀效能随浓度升高及处理时间增长而有所增加。其中,使用培养48h后收集的LB菌液上清处理48h,松材线虫死亡率可高达约50%。之前报道对秀丽隐杆线虫有杀线虫活性的细菌素plantazolicin,经不同突变株上清以及plantazolicin提取物测试,被证实对松材线虫无抑制作用。直接接触实验表明,尽管FZB42的生物膜形成作用会刺激松材线虫提高抗胁迫能力,但整体而言,菌体接触对松材线虫亦有明显抑杀效果。【结论】本研究通过严格细致的测试证明,贝莱斯芽孢杆菌FZB42对松材线虫具有抑杀性,该抑杀作用的分子基础和作用机理有待深入挖掘,但其与plantazolicin无关。作为安全性好、研究开发程度高的一类生防菌株,贝莱斯芽孢杆菌在防治松材线虫病方面的潜在价值值得关注。     

宁夏海原县南华山旧石器考古调查

2020年4-6月,宁夏文物考古研究所与海原县文管所组队对海原县南华山地区进行史前时期遗存专项考古调查。此次调查共发现旧石器地点27处,其中明确地层的有14处。从地层上看可大致分为18000 BP以后的马兰黄土堆积和24000-18000 BP马兰黄土下部河漫滩相堆积两期,分别以石叶-细石叶工业和小石片石器工业为代表。油坊院遗址第1地点和刘湾遗址断面上发现较厚的灰烬堆积,前者还发现有1处明显的火塘遗迹;测年数据显示,两者年代分别为22000 BP cal和11000 BP cal。此次海原县南华山地区旧石器的发现,为研究中国西北地区旧石器晚期文化提供了新的材料,为进一步探讨LGM阶段中国北方旧石器晚期的环境、文化与人群交流等问题提供了新的线索。     

小议石片石器加工程度的测量方法

旧石器考古学中石片石器的研究涉及诸多方面,石片石器加工程度的测量则是其中十分重要的组成部分,目前,已有诸多西方学者提出了不同的测量方法。本文试图在介绍这些方法的同时,对其进行对比和归类分析,提出石片石器加工程度的测量方法目前可分为以"减核率"为核心的测量方法和不以"减核率"为核心的测量方法两大类。针对石器加工程度测量方法目前存在的问题,提出应该在统一的测量标准下,以石器的类型、生产过程和使用过程为基础对石片石器加工程度进行定量测量。     

细菌菌膜的成分、调控及其与植物的关系

菌膜是细菌群落发展的一种高度组织化的群体状态。在菌膜形成过程中,细菌胞外物质EPS(Exopolysaccharides)、eDNA(Extracellular DNA)、胞外蛋白等都参与菌膜的形成,它们为菌膜提供机械稳定性,帮助细菌粘附到物体表面,促进菌膜中不同细菌间物质的循环及基因的水平转移。菌膜形成涉及到群体感应、C-di-GMP(Cyclic diguanylate monophosphate)和sRNA等一系列调控机制。土壤环境中栖息着大量的微生物,许多土壤微生物定殖于植物根际,从而与植物发生着密切的相互作用;菌膜的形成是细菌稳定定殖于植物根际的关键因素,有助于植物促生菌或致病菌在根际更好的生存。本文就菌膜的成分、调控及其与植物的关系等三个方面的内容进行综述。     

细菌生物被膜分散及分子调控机制研究进展

生物被膜分散(Biofilm Dispersal)是生物被膜发展后期细菌响应营养物、低浓度的一氧化氮、D-氨基酸、自诱导肽(Autoinducing Peptide,AIP)、酰基高丝氨酸内酯(Acyl Homoserine Lactones,AHL)、腺苷三磷酸(Adenosine Triphosphate,ATP)等信号变化而做出的一种程序性反应,有利于细菌从恶劣的生物被膜内部环境中脱离出来寻找新的定殖位点。此外,由生物被膜引起的细菌短暂的抗生素耐受性在分散过程中会恢复正常水平,这有助于治疗由致病菌引起的难治愈的生物被膜相关疾病。目前生物被膜分散的相关研究正处于起步阶段,本文希望通过综述生物被膜分散现象、信号分子及调控机制,可以更好地了解细菌生物被膜分散对于防控病原微生物和应用有益微生物的重要意义。     

河南郑州老奶奶庙第3地点初步研究

老奶奶庙第3地点位于河南省郑州市,年代距今约4.5万年或稍早。2016年度的发掘,发现动物化石575件,石制品66件。从遗物的密度和分布情况来看,本遗址应为第1地点或其它中心营地外围的临时性地点,古人类曾在此活动,但并不频繁。动物化石的种属组合揭示出当时应为草原-疏林景观。石制品属于典型的华北地区小石片石器工业,与本区MIS3阶段其他遗址工业面貌相似,应属于同一技术体系。