基于AFM的活体状态外泌体纳米结构及机械特性研究

外泌体在细胞生理病理活动过程中起着重要的调控作用,研究外泌体的行为特性对于揭示生命活动及疾病发生发展的内在机理具有重要的基础意义.然而由于缺乏合适的观测手段及方法,目前对于活体状态下外泌体结构及特性的认知仍然很不足.原子力显微镜(AFM)的发明为研究溶液环境下天然状态生物样本提供了强大的技术工具,已成为生物学重要研究手段.本文利用AFM对单个活体状态外泌体的纳米结构及机械特性进行了研究.通过多聚赖氨酸静电吸附作用将从淋巴瘤患者骨髓中分离的外泌体吸附至基底,在溶液环境下实现了对单个活体状态外泌体的高质量AFM形貌成像并通过与空气中成像结果进行对比揭示了空气干燥处理对外泌体形貌的影响.在此基础上,分别利用AFM压痕试验和多参数成像技术实现了对单个活体状态外泌体机械特性的定量测量和可视化表征.最后基于所建立的方法技术揭示了化学处理后外泌体结构和机械特性的动态变化.研究结果为研究纳米尺度下活体状态外泌体的结构及特性,以更好理解天然状态外泌体的生理行为提供了新的方法和思路,对于外泌体研究具有潜在积极的意义.     

湖南省八大公山国家自然保护区蛾类调查初报

从2007年4月到9月,对八大公山国家自然保护区蛾类昆虫进行了初步调查,共获得蛾类标本4000余号。与湖南农业大学昆虫学教研室以往在八大公山采集保存的蛾类标本1000余号一起,共鉴定出19科175种,其中7种为湖南省新记录种。区系分析结果表明:该地区蛾类昆虫以东洋种为主。     

基于多参数成像AFM的细胞及分子力学特性探测研究进展

原子力显微镜(AFM)的发明为微纳尺度下高分辨率探测天然状态生物样本的物理特性提供了强大工具,是对传统生化特性检测方法的有力补充.近年来,多参数成像模式AFM的出现使得人们不仅可以获取生物样本表面形貌特征,还能同时获取生物样本多种力学特性图(如杨氏模量、黏附力、形变等),为研究生物结构、力学特性及其生理功能之间的关联提供了新的技术手段.多参数成像AFM的生物医学应用研究为细胞/分子生理活动及相关疾病内在机理带来了大量新的认识.本文结合作者在AFM细胞探测方面的研究工作,介绍了多参数成像AFM工作原理,总结了多参数成像AFM在细胞及分子力学特性探测方面的研究进展,并对其存在的问题进行了讨论和展望.     

湖南乌云界蝴蝶物种多样性及区系特点研究

2008～2010年,采用路线法对湖南省乌云界国家级自然保护区的蝶类物种多样性进行了为期近3年的调查,共记录蝴蝶147种,隶属于10科94属。蛱蝶科Nymphalidae Swainson,1827种类最多,弄蝶科Hesperiidae Latreille,1809的多样性指数最大。凤蝶属Papilio Linnaeus,1758对属多样性指数贡献值相对较大。记录国家保护种4种(宽尾凤蝶Agehana elwesi、中华虎凤蝶Luehdorfia chinensis、箭环蝶Stichophthalma howqua、大伞弄蝶Bibasis miraculata),其中中华虎凤蝶属于国家二级重点保护动物;湖南省新纪录种3种(金斑剑凤蝶Pazala alebion、报喜斑粉蝶Delias pasithoe和泰环蛱蝶Neptis thestias);宽边黄粉蝶Eurema hecabe采集数量最多(69头),是该保护区优势种群。蝶类昆虫区系主要以东洋成分为主,兼有古北和广布成分。     

基于AFM单细胞力谱技术的淋巴瘤细胞黏附力测量

细胞黏附在细胞生理功能中起着重要的调控作用,对细胞黏附行为进行定量研究有助于理解生命活动内在机制.原子力显微镜（AFM）的出现为研究溶液环境下微纳尺度生物系统的生物物理特性提供了强大工具,特别是AFM单细胞力谱（SCFS）技术可以对单细胞黏附力进行测量.但目前利用SCFS技术进行的研究主要集中在贴壁细胞,对于动物悬浮细胞黏附行为进行的研究还较为缺乏.本文利用AFM单细胞力谱技术（SCFS）对淋巴瘤细胞黏附行为进行了定量测量.研究了淋巴瘤细胞与其单克隆抗体药物利妥昔（利妥昔单抗与淋巴瘤细胞表面的CD20结合后激活免疫攻击）之间的黏附力,分析了利妥昔浓度及SCFS测量参数对黏附力的影响,并对淋巴瘤细胞之间的黏附力进行了测量.实验结果证明了SCFS技术探测动物悬浮细胞黏附行为的能力,加深了对淋巴瘤细胞黏附作用的认识,为单细胞尺度下生物力学探测提供了新的可能.     

乌云界国家级自然保护区蝴蝶物种多样性及其保护

2008年6月至2010年9月采用路线法对湖南乌云界国家级自然保护区蝴蝶物种多样性进行了调查,针对4条调查路线31个样线段的植被物种丰富度、海拔高度、离水源距离和人为干扰程度等影响蝴蝶物种丰富度的主要因子,开展多元回归分析比较,同时对试验区、缓冲区和核心区3个规划区域进行蝴蝶群落多样性分析和相似度比较.共采集记录到蝴蝶147种,隶属于10科94属,其中国家保护种4种;多元回归分析表明,植被物种丰富度、海拔高度和人为干扰程度是影响蝴蝶分布最主要的3个因子,其中植被物种丰富度与蝴蝶物种丰富度存在极显著正相关(P＜0.01),海拔高度和人为干扰程度与蝴蝶物种丰富度存在显著负相关(P＜0.05);核心区的蝴蝶物种丰富度、多样性指数均高于缓冲区和试验区,试验区的优势度指数较高;缓冲区与核心区的相似度系数较高,达到0.526.该自然保护区蝴蝶物种多样性的保护重点在于保护植物群落多样性,保持林相之间的自然演替,适当减少人为干扰,以及加强特殊蝴蝶生境的维护.     

结合原子力显微镜和光学图像识别的单细胞力学特性快速测量研究

目的 细胞力学特性在生理病理变化过程中起着关键调控作用,开展细胞力学特性研究为揭示生命活动奥秘及疾病发生发展演变规律提供了新的视角。原子力显微镜（AFM）的出现为单细胞力学特性研究提供了强大的技术手段。AFM的独特优势是不需要对活细胞进行任何预处理即可在溶液环境下对天然状态的活细胞力学特性进行高精度（纳米级空间分辨率,皮牛级力感知灵敏度）探测。基于AFM压痕实验的细胞力学特性探测已成为生命科学领域的重要研究方法。然而,现有基于AFM的单细胞力学特性测量主要依赖于人工操作,特别是在测量过程中需要人工控制AFM探针移动到细胞表面特定位置进行压痕实验,导致实验过程耗时费力且效率低下。本文通过将AFM与光学图像自动识别相结合建立了单细胞力学特性快速测量方法。方法 分别利用UNet++深度学习网络模型和模板匹配算法识别出光学图像中的细胞及AFM探针,在此基础上自动确定细胞和AFM探针之间的空间位置关系,并控制AFM探针准确移动至目标细胞表面进行压痕实验。在光学显微镜视觉导引下利用AFM微操作将单个微球黏附至AFM探针悬臂梁制作得到球形针尖探针。选取HEK 293（人胚胎肾细胞）和MCF-7（人乳腺癌细胞）两种细胞进行实验。利用Hertz-Sneddon模型对在细胞表面获取的力曲线进行分析得到细胞杨氏模量。结果 基于光学图像识别结果可将AFM探针针尖准确移动至目标细胞（HEK 293或MCF-7）并对细胞力学特性进行测量,同时实验结果表明本文所提出的方法不仅适用于常规AFM锥形针尖探针,也适用于AFM球形针尖探针。结论 将AFM与光学图像识别结合显著提升了AFM细胞力学特性测量效率,为高通量自动化AFM单细胞力学特性探测提供了新的方法和思路,对于细胞力学特性研究具有广泛的积极意义。     

大黄素对人肝癌HepG2细胞AIF和EndoG蛋白表达的影响

目的:观察大黄素干预后,体外培养的人肝癌HepG2细胞株胞浆和胞核内AIF和EndoG的表达情况,探讨大黄素对非Caspase依赖细胞凋亡的影响.方法:将体外培养的HepG2细胞分为四组:空白对照组、Caspase抑制剂组、大黄素干预组、大黄素+Caspase抑制剂组;取对数生长期的细胞进行实验,药物作用48小时后提取各组细胞胞浆及胞核蛋白;采用Western Blotting法分别检测各组细胞胞浆和胞核内AIF与EndoG的表达,并进行统计学分析.结果:AIF和EndoG在大黄素干预组、大黄素+Caspase抑制剂组细胞胞浆和胞核的表达均高于空白对照组及Caspase抑制剂组(p＜0.01),其中以大黄素+Caspase抑制剂组的表达最高(p＜0.01).结论:大黄素能促进体外培养的人肝癌HepG2细胞AIF和EndoG的表达和核转位,可以通过非Caspase依赖途径诱导细胞凋亡.     

基于原子力显微镜的溶液流动环境下癌细胞力学特性测量研究

目的 细胞力学特性在细胞生理病理活动过程中起着重要的调控作用，开展细胞力学特性研究对于揭示生命活动内在规律具有重要意义。原子力显微镜（AFM）的发明为单细胞力学特性表征提供了新的强大工具，基于AFM压痕分析的细胞力学特性探测已成为生命科学领域的重要研究方法，为单细胞行为研究带来了大量新认识。然而，现有基于AFM的细胞力学特性研究主要集中在静态溶液环境，而癌细胞在体内转移过程中处于脉管系统的动态液流环境下，因此现有的测量结果无法完全反映溶液流动环境下的癌细胞真实生理行为，特别是目前对于肿瘤转移过程中液流环境与癌细胞之间相互作用的力学机制的认知还十分有限。本文通过将AFM与液流控制技术结合建立了溶液流动环境下的细胞力学特性测量方法。方法 基于两侧开口培养皿并结合注射泵/抽取泵液流控制搭建细胞培养基动态液流系统，并将其分别与AFM及光学倒置显微镜进行集成。选取MCF-7（人乳腺癌细胞）和HGC-27（人未分化胃癌细胞）两种癌细胞进行实验。利用细胞培养基动态液流系统培养细胞并分析溶液流速以及流动时间对细胞生长及力学特性的影响。在光学显微镜导引下控制AFM对培养基静态/流动环境下生长的细胞进行压痕实验以获取力曲线，并利用Hertz-Sneddon模型对力曲线进行分析得到细胞杨氏模量。利用荧光染色试剂分析溶液流动环境对细胞活性及细胞骨架蛋白的影响。结果 首先分析了溶液流动环境对细胞生长的影响，实验结果表明，与静态培养环境相比，培养基动态液流环境可更好地促进细胞生长。随后分别对静态和流动环境下生长的癌细胞力学特性进行了测量，结果表明当癌细胞生长环境由静态变为动态后细胞的杨氏模量显著减小，且溶液流动环境会导致细胞骨架结构的变化，显示了溶液流动环境对癌细胞力学特性的显著影响。结论 将AFM与液流控制技术结合可对溶液流动环境下的单细胞力学特性进行探测，为研究溶液流动环境与癌细胞之间的相互作用提供了新的方法和思路。     

不同垦复方式油茶林土壤节肢动物多样性特征

【目的】油茶新造林特别是纯林不断骤增导致油茶林害虫发生日趋严重,食用茶油安全倍受威胁。为探索有效控制油茶林害虫发生的途径,保护分解者跳虫等土壤节肢动物多样性。【方法】基于Tullgren干漏斗法和巴氏罐法,对半垦复油茶幼林、全垦复油茶幼林、全垦复油茶成林和未垦复油茶成林4种不同油茶林的20个土样和15个凋落物样中的土壤跳虫和土壤其他节肢动物多样性特征进行了研究。【结果】共分离出跳虫315头,隶属6科8属;其他土壤节肢动物11科17种295头。多样性分析结果表明,油茶成林地比幼林地土壤动物的多样性指数高,多样化的地被物有利于提高土壤动物的多样性,垦复和施肥等人为干扰显著地降低土壤跳虫的多样性,却有利于增加罐诱土壤动物的多样性,水源是土壤动物生存的关键因子,对林地跳虫和罐诱动物的多样性提高有显著促进作用。【结论】探明了不同垦复类型油茶林土壤跳虫和土壤其他罐诱节肢动物多样性特征,对合理开展油茶林垦复,发挥油茶林土壤跳虫和土壤节肢动物分解功能提供了科学依据。