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Xist是与X染色体失活相关的非编码基因,它在合子期基因组开始表达,是胚胎发育早期表达的第一个印记基因。探讨了特异性抑制Xist的TALER-REPRESSOR(TALER)载体转染到胎牛成纤维细胞对Xist基因的抑制作用,并以抑制Xist基因表达的细胞作为核供体制作克隆胚胎,研究Xist基因抑制对牛克隆胚早期发育的影响。结果显示,与对照组细胞相比,TALER载体将Xist相对表达量下调了93.85%,说明本试验设计的载体转染系统能够有效抑制Xist基因的表达。选取Xist抑制表达阳性的转染细胞用于体细胞核移植试验,克隆胚胎发育结果显示,试验组和对照组的卵裂率、8细胞发育率、桑葚胚发育率和囊胚发育率分别为78.8%vs 75.1%(P0.05,无显著差异)、54.4%vs 50.6%(P0.05,无显著差异)、12.3%vs 27.8%(P0.01,差异极显著)、0 vs 26.6%(P0.01,差异极显著)。综上所述,试实验设计的特异性抑制Xist表达的TALER载体可有效抑制雌性胎牛成纤维细胞中Xist的表达。供体细胞Xist这种基因下调可使克隆胚胎2-8细胞率略有提升,但囊胚期和桑葚胚率明显降低。因此,其机制尚待于进一步探讨。 相似文献
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通过体细胞核移植技术制作了人胰岛素原转基因牛。在CMV启动子指导下以内部核糖体进入位点序列(IRES)连接的新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因组成了双重标记基因的筛选系统,用于转基因细胞的富集以及细胞和植入前胚胎的筛选。转基因通过电穿孔的方法(900 V/cm, 5 ms)转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,基因转染细胞在添加G418(800 μg/mL) 的培养基中培养10天以富集转基因细胞。选择表达绿色荧光蛋白的转基因细胞作为核供体进行体细胞核移植,重构胚经体外培养至囊胚阶段,选择表达绿色荧光蛋白的囊胚进行胚胎移植。为比较基因转染以及供体细胞所处周期对转基因细胞核移植胚胎发育的影响,用作核移植供体的转基因细胞或非转基因细胞先饥饿培养2—4天(0.5% FBS),然后恢复培养(10% FBS)10?h使细胞同步化于G1期,以正常培养的细胞作为对照进行核移植。 结果表明,转基因细胞作为核供体得到的核移植胚胎的体外囊胚发育率低于以非转基因细胞为核供体的对照组(23.2% VS 35.2%, P<0.05);转基因细胞周期同步化处理与否对其克隆胚囊胚发育率无显著影响(23.2% VS 18.9%, P>0.05)。胚胎移植后2个月直肠检查发现7头受体牛(每头移植2—4枚胚胎)中有一头妊娠,并最终发育足月产下一头小牛。聚合酶链反应(PCR)检测和DNA测序分析表明其为转人胰岛素原基因的转基因克隆牛。 相似文献
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本研究以内蒙古乌珠穆沁白马(Equus caballus)雄性和雌性为实验材料,利用组织块贴壁培养法进行耳组织成纤维细胞原代建系,研究耳组织来源的细胞贴壁率、冷冻前及复苏后存活率、生长曲线,进一步绘制乌珠穆沁白马成纤维细胞核型图。实验结果显示,雌、雄乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞经组织贴壁法建系培养,生长为典型的成纤维细胞形态,并呈现“S”型生长曲线特征;细胞冷冻前后存活率存在显著差异,但仍具有较好的耐受冷冻性;根据染色体核型分析,雌、雄乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞染色体条数为2n = 64,其中31对常染色体,1对性染色体。本研究成功建立了雌、雄乌珠穆沁白马耳组织成纤维细胞系,并且得到可稳定培养、具有良好遗传学特性的细胞系,为后续的相关深入研究奠定了基础。 相似文献
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用组织块培养法对毛脚鵟不同组织进行原代培养,获得了3种不同组织来源的细胞,并成功对细胞进行了冷冻保存和复苏。在传代培养过程中,对比分析了3种组织来源细胞的形态学、生长曲线、贴壁率、核型等生物学特性。形态学方面,3种来源细胞均为成纤维样细胞。对于3种组织来源细胞的贴壁能力分析显示,输卵管源细胞最强,肺源细胞和气管源细胞次之。3种不同组织来源细胞的倍增时间分别为(29.91±0.39)、(33.18±0.21)和(30.67±0.28)h,群体倍增次数分别为3.54±0.01、4.52±0.02和4.38±0.03。毛脚鵟细胞的染色体数目为2n=68,性染色体为典型的ZW型。本实验为今后毛脚鵟细胞利用、遗传信息的保存及生物学特性的深入研究提供实验材料和依据。 相似文献
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中华鼢鼠(Eospalax fontanierii)为蒙古高原代表性动物遗传资源,本研究采集中华鼢鼠心、肝、脾、肺、肾、肌肉、气管、剑状软骨和尾尖皮肤共9种组织用于实验,其中气管、肺和剑状软骨3种组织成功建立成纤维细胞系,传了8代,并分析了这些细胞的生物学特性。主要实验方法是通过细胞计数法计算细胞的贴壁率、冻存前及复苏后的存活率、绘制细胞生长曲线;制备常规染色体标本分析染色体核型。实验结果显示,中华鼢鼠气管、肺、软骨3种组织在体外条件下培养,第3~4天出现成纤维样细胞,原代细胞分别在培养第11天、第16天、第17天,达到90%以上汇合。3种组织来源体细胞均显示成纤维细胞特征,气管成纤维细胞贴壁能力最强,24 h贴壁率最高能达到98.10%,肺成纤维细胞与剑状软骨成纤维细胞贴壁能力较弱,24 h贴壁率最高,分别为95.28%和94.88%。3种来源成纤维细胞生长曲线测定结果显示,气管成纤维细胞的增殖能力最强、肺成纤维细胞次之、剑状软骨成纤维细胞最弱。气管成纤维细胞和肺成纤维细胞在接种后的第6~7天,进入对数生长期。剑状软骨成纤维细胞在接种后第2~3天进入对数生长期。3种成纤维细胞的生长曲线均呈"S"型,其中气管成纤维细胞增殖能力最强,在24孔板的每个孔中,其最大增殖数目为2.435×10~4个,肺成纤维细胞最大增殖数目为1.813×10~4个,剑状软骨成纤维细胞最大增殖数目为1.521×10~4个。核型分析结果显示,中华鼢鼠的成纤维细胞染色体数目为2n=62,30对为常染色体,1对为性染色体。综上所述,本研究成功建立了中华鼢鼠成纤维细胞体外培养体系,并揭示了该物种成纤维细胞的基本生物学特性,为深入研究中华鼢鼠适应低氧高二氧化碳洞道生境的分子生物学和生理学机制提供了条件,为进一步研究其遗传及物种进化提供了实验材料和参考。 相似文献
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通过体细胞核移植技术制作了人胰岛素原转基因牛。在CMV启动子指导下以内部核糖体进入位点序列(IRES)连接的新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白基因组成了双重标记基因的筛选系统,用于转基因细胞的富集以及细胞和植入前胚胎的筛选。转基因通过电穿孔的方法(900V/cm,5ms)转入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,基因转染细胞在添加G418 (800μg/mL)的培养基中培养10天以富集转基因细胞。选择表达绿色荧光蛋白的转基因细胞作为核供体进行体细胞核移植,重构胚经体外培养至囊胚阶段,选择表达绿色荧光蛋白的囊胚进行胚胎移植。为比较基因转染以及供体细胞所处周期对转基因细胞核移植胚胎发育的影响,用作核移植供体的转基因细胞或非转基因细胞先饥饿培养2—4天(0.5 ?S) ,然后恢复培养(10?S) 10 h使细胞同步化于G1期,以正常培养的细胞作为对照进行核移植。结果表明,转基因细胞作为核供体得到的核移植胚胎的体外囊胚发育率低于以非转基因细胞为核供体的对照组(23.2% VS 35.2 %,P<0.05) ;转基因细胞周期同步化处理与否对其克隆胚囊胚发育率无显著影响(23.2% VS 18.9 %,P>0.05)。胚胎移植后2个月直肠检查发现7头受体牛(每头移植2—4枚胚胎)中有一头妊娠,并最终发育足月产下一头小牛。聚合酶链反应(PCR)检测和DNA测序分析表明其为转人胰岛素原基因的转基因克隆牛。 相似文献
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本研究以内蒙古大青山获得野生雄性和雌性西伯利亚狍(Capreolus pygargus)为实验材料,利用组织块贴壁培养法进行气管、肺和耳3种组织成纤维细胞原代建系,研究不同组织来源的细胞贴壁率、冷冻前及复苏后存活率、生长曲线,进一步绘制狍成纤维细胞核型图并分析其G带特征。实验结果显示,气管、肺和耳3种组织成纤维细胞增殖经历潜伏期、对数生长期、平台期三个阶段,细胞形态为梭形、三角形或不规则形,是典型成纤维细胞形态;成纤维细胞呈漩涡状生长,其中气管、耳成纤维细胞生长增殖能力最强、肺成纤维细胞增殖能力较弱,气管和耳组织来源成纤维细胞呈典型“S”型细胞生长特征。染色体核型及G带分析结果显示,雄性狍成纤维细胞染色体条数为2n=70,其中,有34对常染色体,形态类型为12条近端着丝粒染色体(st),22条亚中着丝粒染色体(sm),1对性染色体,X染色体为中着丝粒染色体(m),Y染色体为近端着丝粒染色体(st),5条超数染色体(B);雌性狍成纤维细胞染色体条数为2n=70,其中,有34对常染色体,其形态类型为29条亚中着丝粒染色体(sm),5条近端着丝粒染色体(st),1对为性染色体,X染色体为亚中着丝粒染色体(sm),8条超数染色体(B)。本研究成功建立了雄性和雌性西伯利亚狍气管、肺和耳3种组织来源的成纤维细胞系,在体外培养时生长状态良好且维持了细胞的遗传信息稳定性,绘制了西伯利亚狍雄性和雌性染色体核型及G带图谱,为将来更深入开展相关研究提供材料与基本技术支撑。 相似文献