S-亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达系统的构建及手性胺的合成

旨在构建S-亚胺还原酶(S-IRED)和葡萄糖脱氢酶(GDH)在大肠杆菌中的一菌双酶共表达系统,实现辅酶NADPH的再生,高效合成手性仲胺。利用无缝克隆的手段设计构建一种单质粒双启动子共表达系统,以全细胞为催化剂催化手性仲胺S-2-甲基吡咯烷(S-2MP)的合成,并研究温度、pH及有机溶剂对双酶反应的影响。成功构建了S-IRED和GDH的重组共表达质粒,实现了S-IRED与GDH在大肠杆菌中的胞内共表达,以亚胺2-甲基吡咯啉(2MPN)为模式底物,以工程菌全细胞催化手性仲胺S-2MP的合成,在低辅酶添加时催化手性胺的产率和光学纯度均高于95%。该双酶共表达体系的最适温度和pH分别为37℃和pH 8,10%以下的甲醇对双酶反应有正向促进作用。大肠杆菌胞内双酶共表达系统的构建实现了辅酶NADPH的原位再生,降低了亚胺还原酶催化合成手性胺的成本,为手性胺的规模制备奠定了基础。     

N-脱氧核糖转移酶II催化合成克拉屈滨及其定向进化

目的:使用表达N-脱氧核糖转移酶Ⅱ (Nucleoside deoxyribose transferase, NDT)的大肠杆菌重组工程菌E.coli BL21/pET-NDT,作为催化剂,合成克拉屈滨(Cladribine)。同时构建高通量的酶活筛选体系,利用其改造NDT,以期提高克拉屈滨的合成效率。方法:首先用野生型NDT催化克拉屈滨的合成。接着以黄嘌呤氧化酶和辣根过氧化物酶联合作用来检测NDT酶活。最后构建NDT随机突变体库,并筛选出突变体。结果:在10%DMSO的体系中,野生型NDT催化2-氯腺嘌呤合成克拉屈滨的转化率达到93%。同时使用构建的筛选体系在突变体库中筛选到了酶活发生改变的突变体。结论:本研究使用NDT作为催化剂,成功地一步合成了克拉屈滨。同时本研究构建的高通量筛选方法成功应用于改造NDT的酶学性质,为拓展NDT合成核苷类似物的能力提供了一种新的方法。