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1.
研究利用Red同源重组技术对常用大肠杆菌表达宿主菌BL21(DE3)进行改良, 构建破菌时可自动降解宿主核酸的大肠杆菌表达宿主菌, 该菌株可望有助于解决因破菌时宿主菌染色体核酸释放给后续纯化重组蛋白工作带来的困难。将N端连有OmpA的信号肽的S. aureus nucleaseB(nucB)表达框整合至E. coli BL21(DE3)的lpxM位点, 改造后菌株(称为BLN)经诱导能表达nucB、并分泌至周质空间, 这样可使宿主核酸免受该酶“毒性”影响, 菌体裂解后, nucB释放,能自动降解宿主核酸。BLN菌体生长状态以及表达外源重组蛋白的能力与出发菌基本一致。  相似文献   
2.
目的:研究胸腺肽α1(Tα1)与Spl DnaX内含肽融合蛋白AS的体外切割动力学。方法:构建Tα1和SplDnaX内含肽的融合表达载体pET-AS,转化大肠杆菌BL21(DE3),经乳糖诱导获得可溶性表达的融合蛋白AS,用镍亲和层析纯化该蛋白;综合评价温度、β-巯基乙醇(β-ME)浓度和诱导切割时间对Spl DnaX内含肽介导融合蛋白AS自切割释放Tα1的影响。结果:在大肠杆菌中诱导表达了融合蛋白AS,经镍柱纯化获得该蛋白;随着温度升高和β-ME浓度增加,诱导切割时间延长,Spl DnaX内含肽介导的切割率逐渐增大;最终采用300 mmol/Lβ-ME切割24 h,融合蛋白的硫解切割率大于90%。结论:通过对Spl DnaX内含肽的诱导切割条件进行摸索,确定了最适宜的切割条件,为利用该方法制备Tα1和其他小分子多肽提供了技术基础。  相似文献   
3.
用改良的MTT法测定rhG-CSF活性   总被引:2,自引:1,他引:1  
MTT测定法是根据线粒体脱氢酶催化MTT形成蓝色甲■的多少来检测活细胞数和功能状态的,但原始方法中存在着一些问题,如敏感性偏低、有机溶剂产生蛋白质沉淀以及产物的溶解度偏低等。为了摸索测定 rhG-CSF活性的最适条件,我们以 NFS-60细胞为对象,比较了多种溶解缓冲液,并且对细胞数、MTT浓度及保留时间、溶解液用量等条件进行了选择。结果表明,DMF-20%SDS和 20%SDS的效果最好,测定时细胞数为每孔 1000个细胞,所加 MTT浓度为 1mg/ml,保留时间为 4 h,溶解液的用量为每孔 100μl。  相似文献   
4.
目的:在大肠杆菌中表达人胸腺肽β4(Tβ4)的融合蛋白,通过CDAP介导的化学切割将融合部分切除,获得人Tβ4。方法:分别以质粒pET-Tβ4和pET-L12为模板,扩增Tβ4和核糖体亚基蛋白L12的基因片段,再以这2段基因为模板进行重叠PCR,并在连接处引入一个半胱氨酸(Cys)密码子,将得到的融合蛋白Tβ4-Cys-L12基因片段与pET-22b载体连接,构建表达质粒,将其与N-末端乙酰转移酶质粒共转化至大肠杆菌BL21(DE3)并共表达,获得N端乙酰化修饰的融合蛋白Tβ4-Cys-L12;利用CDAP氰基化Cys的巯基,于pH10.0条件下在Cys残基N端完成切割,分离纯化获得Tβ4。结果:质谱分析目的产物相对分子质量为4962.70,与天然Tβ4一致,表明获得了Tβ4。结论:CDAP介导的化学法可以有效切割融合蛋白获得Tβ4,建立了一套Tβ4的生物制备方法。  相似文献   
5.
目的:探讨血清学指标检验在脂肪肝患者临床诊断中的应用价值。方法:收集2013年3月-2014年3月于我院接受治疗的脂肪肝患者42例,作为观察组;选取同一时间我院体检科健康查体者42例,作为对照组。比较两组血清学指标检验结果,并分析其在脂肪肝临床诊断中的价值。结果:观察组患者丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)水平明显高于对照组健康查体者,两组比较差异均具有统计学意义(t=11.42、13.17,P0.05);观察组患者血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)水平明显高于对照组健康查体者,两组比较差异均具有统计学意义(t=7.35、8.02,P0.05)。结论:血清ALT、AST、TG、TC指标在脂肪肝患者临床诊断中存在重要的临床应用价值,可作为临床监测脂肪肝的重要方法,值得推广。  相似文献   
6.
胸腺肽β4(Tβ4)是N-末端乙酰化的43肽,具有多种重要生物学功能.其生物合成存在两大难点,即乙酰化修饰和小分子肽的表达.本研究发现来自古菌Sulfolobus solfataricus的乙酰化酶ssArd1可以催化Tβ4的N-末端乙酰化修饰.利用Red同源重组技术将ssArd1基因表达盒整合至E.coli BL21(DE3)染色体的lpxM位点上,构建了可以实现Tβ4N-末端乙酰化修饰的新型宿主E.coli BDA.将Tβ4编码基因融合在改造的微型Spl DnaX Intein的N端,并在Intein的C端添加His标签,构建了表达载体pET-Tβ4-Intein.在E.coli BDA中表达的融合蛋白,经镍亲和层析纯化后用β-巯基乙醇诱导融合蛋白切割释放小分子多肽,获得了具有N-末端乙酰化的Tβ4.  相似文献   
7.
目的:分析持续皮下注射胰岛素对2型糖尿病(T2DM)合并肺部感染患者的临床疗效。方法:将我院2010年6月至2013年6月收治的86例2型糖尿病合并肺部感染患者随机分为2组,分别采用胰岛素泵持续皮下注射(治疗组)和多次皮下注射胰岛素(对照组),观察患者血糖指标、血糖达标时间、低血糖发生率及肺部感染治愈率情况。结果:治疗后,两组患者的血糖均得到控制,治疗组的血糖指标变化、血糖达标时间及住院时间均优于对照组,差异均有统计学意义(均P0.05)。治疗组的低血糖发生率明显低于对照组,而肺部感染治愈率显著高于对照组,差异均有统计学意义(均P0.05)。结论:胰岛素泵持续皮下胰岛素注射在治疗2型糖尿病合并肺部感染患者中使用,血糖达标迅速,降低低血糖发生率,缩短住院时间,提高感染治愈率,临床效果好。  相似文献   
8.
胸腺素α1的乙酰化修饰不依赖于乙酰转移酶RimL   总被引:1,自引:1,他引:0  
目的:考察大肠杆菌乙酰转移酶RimL对胸腺素α1(Tα1)乙酰化修饰的影响。方法:构建含500bp同源臂的卡那抗性基因打靶片段,利用Red同源重组系统,使大肠杆菌B121(DE3)的rimL基因插入失活,随后导入质粒pCP20去除抗性基因,构建突变菌株rimL-BL21(DE3);将重组质粒pET-Tα1-L12分别转入出发菌株和突变菌株中进行表达,经固定金属离子亲和层析和反向高效液相层析后,将所得纯品进行质谱分析,精确测定相对分子质量。结果:PCR鉴定结果证明成功敲除rimL基因;质谱结果表明,rimL基因敲除菌中所表达的Tα1-L12融合蛋白与出发菌株一样,均有部分乙酰化修饰。结论:Tα1的乙酰化修饰并不依赖于RimL。  相似文献   
9.
一般蛋白质样品的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)通常只用一种浓度的分离胶(单层分离胶)。我们发现,将这种方法用于未经处理的重组人表皮生长因子(rhEGF)发酵液的电泳时,效果不好。我们推测可能是由于发酵液成分复杂,蛋白分子大小不均。基于这种考虑,我们就分离胶浓度对电泳效果的影响进了一些探索。  相似文献   
10.
通过一种新方法使T7基因I置换araBAD基因簇   总被引:1,自引:1,他引:0  
目的:用T7 RNA聚合酶基因T17基因I置换大肠杆菌基因组中的araBAD基因簇.方法:通过分析大肠杆菌基因组中araBAD基因序列,设计两侧同源臂,构建高拷贝数的打靶质粒,并且在这个质粒上的打靶片段两侧各加上一个归巢内切酶位点;将辅助质粒和打靶质粒同时转化到宿主体内,在L-阿拉伯糖的诱导下表达归巢内切酶和Red重组酶,实现体内重组,使T7基因I置换araBAD基因簇.结果:在4株不同的大肠杆菌中用T7基因I置换了araBAD基因簇.结论:成功地将T7基因,整合到araBAD基因位置,为构建Para-PT7表达系统奠定了基础.  相似文献   
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