温室白粉虱触角miRNA转录组分析及调控嗅觉相关基因miRNA的鉴定

microRNA(miRNA)是一类真核生物中内源性的非编码小RNA,在基因转录后水平调控靶基因的小分子.温室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)是一种危害多种蔬菜、花卉及农作物等的世界性害虫,可以导致植物细菌性病害的传播和流行,其触角对温室白粉虱的取食、行为和生长发育等起到了重要作用.本研究以温室白粉虱成虫触角为材料,通过Illumina高通量测序平台对其miRNA转录组进行测序,结合生物信息学分析,鉴定到83个已知miRNAs和38个新miRNA(novel_mirs),并对它们表达水平进行定量分析.此外,对已知miRNA种子序列碱基编辑情况进行了调查.最后,利用生物信息学工具对miRNAs进行靶基因预测和功能注释,获得了 miRNA-靶基因关系及调控嗅觉相关基因的miRNAs.本研究为深入探讨温室白粉虱触角miRNA中嗅觉相关基因的调控关系,了解昆虫嗅觉形成的分子机制提供了参考.     

草地贪夜蛾幼虫肠道细菌的分离鉴定及纤维素降解细菌的筛选

【目的】本研究旨在明确草地贪夜蛾Spodopterafrugiperda幼虫肠道可培养细菌组成,筛选纤维素降解细菌。【方法】采用传统细菌培养及16S rDNA分子标记相结合的方法分离鉴定草地贪夜蛾幼虫肠道可培养细菌;采用刚果红染色法筛选纤维素降解细菌,并通过3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定不同pH(5.0-9.0)条件下的纤维素酶活力。【结果】从草地贪夜蛾幼虫中筛选分离出14种肠道细菌菌株,分别隶属放线菌门(Actinobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)等3门11属,即谷氨酸棒杆菌属(Glutamicibacter)、肠球菌属(Enterococcus)、芽胞杆菌属(Bacillus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)、摩根菌属(Morganella)、肠杆菌属(Enterobacter)、志贺氏菌属(Shigella)、克洛诺杆菌属(Cronobacter)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、沙雷氏菌属(Serratia)、苍白杆菌属(Ochrobactrum)。2株产纤维素酶细菌隶属厚壁菌门芽胞杆菌属。酶活力测定结果显示:2株纤维素降解细菌的纤维素酶在pH 6.0-8.0均有相对较高的活性,在pH 8.0时,纤维素酶活最高。【结论】草地贪夜蛾幼虫肠道中细菌种类多样,其肠道内存在纤维素降解细菌。在偏碱性条件下,纤维素降解细菌的纤维素酶活力显著高于酸性条件。研究结果丰富了纤维素降解细菌资源,在饲料生产、食品加工、化学能源等方面具有应用前景。此外,草地贪夜蛾作为重大农业害虫,其肠道有益菌群,有望成为新的防治靶标。     

抑制猪霍乱沙门氏菌的乳酸菌的分离、鉴定及潜在抑菌物质分析

猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)是一种常见的食源性致病菌。为了预防和治疗该菌引起的疾病,饲养者在饲料中大量添加抗生素,致使猪肉存在严重的食品安全问题。从健康成年无量山乌骨鸡肠道内容物中筛选出具有抑菌作用的乳酸菌,测定其对猪霍乱沙门氏菌的抑菌效果,分析乳酸菌抑制猪霍乱沙门氏菌的有效成分,并对筛选的乳酸菌种进行了分子生物学鉴定。采用双层平板法对具有抑制猪霍乱沙门氏菌的乳酸菌进行筛选,采用牛津杯法对抑菌效果进行测定,并采用酶蛋白敏感性测定、热处理、有机酸处理等方法分析抑菌活性物质有效成分,采用16S rDNA分子标记对乳酸菌进行鉴定,并构建系统发育树。结果显示,从健康鸡肠道中筛选出18株乳酸菌,其中2株对猪霍乱沙门氏菌(Salmonella choleraesuis)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肠炎沙门氏菌(Salmonella enteritidis)、肠炎沙门氏菌亚种(Salmonella enteritidis subspecies)、志贺氏菌(Shigella)、无乳链球菌(Streptococcus agatactiae)具有良好的抑菌效果;不同蛋白酶、pH处理对乳酸菌无细胞培养液抑菌效果均有不同程度的影响,但是经80℃处理的乳酸菌无细胞培养液,其抑菌效果未明显改变。经鉴定,2株乳酸菌分别为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)和短乳杆菌(Lactobacillus brevis)。从健康成年无量山乌骨鸡肠道内容物中分离得到的植物乳杆菌菌株L2和短乳杆菌菌株L4对猪霍乱沙门氏菌等致病菌具有明显地抑制作用,推测其抑菌有效成分可能为小肽类及有机酸,这对减少抗生素使用,提高猪肉食品的品质与安全性具有一定价值。     

西方蜜蜂工蜂肠道菌群定殖起始点和定殖稳态点的结构比较分析

【目的】目前,针对昆虫肠道细菌定殖规律的研究还未见报道。探索西方蜜蜂(Apis mellifera)肠道菌群定殖过程两个重要时间节点(起始0日龄和稳态7日龄)间肠道细菌群落(菌群)结构组成的差异,加深对蜜蜂及昆虫肠道菌群定殖规律的认识。【方法】分别采集两个化蛹后工蜂发育阶段的个体各5只,分别解剖并提取其肠道菌群DNA。使用Illumina技术对肠道菌群16S rD NA高变区进行高通量测序。通过生物信息学的分析方法对肠道菌群进行多样性分析,并对两个时间点相对丰度最高的肠道菌群进行统计分析,比较肠道菌群相对丰度和组成的差异。【结果】共获得515156条高质量序列,长度为227904953bp,平均长度为442bp。基于OTUs的分类表明,工蜂肠道细菌分别隶属于34个门82个纲221个目405个科799个属。此外,工蜂肠道菌群定殖起点和终点间的Alpha多样性指数存在显著差异(ACE,P=0.0014;Chao,P=0.0013;Shannon,P=0.0003;Simpson,P=0.0028,Student’s t检验)。此外,相较0日龄工蜂,7日龄工蜂肠道中的乳酸杆菌Lactobacillus、Gilliamella、双歧杆菌Bifidobacterium、Snodgrassella4个属的相对丰度显著增加;相反,不动杆菌Acinetobacter、大肠杆菌志贺氏菌Escherichia-Shigella、鞘脂单胞菌Sphingomonas、类杆菌Bacteroides、涅斯捷连科氏菌Nesterenkonia、栖热菌Thermus6个属的细菌相对丰度显著降低(P0.05)。【结论】出房(0日龄)成年工蜂的肠道菌群多样性显著高于菌群定殖完成(7日龄)工蜂的肠道菌群多样性,且成年工蜂肠道菌群定殖完成前后部分类群的相对丰度显著改变。本研究的结果不仅可增加我们对蜜蜂肠道菌群定殖规律的认识,也能够为研究其他昆虫肠道菌群的定殖规律提供重要的参考信息。     

七星瓢虫触角转录组及嗅觉相关基因分析

【目的】瓢虫科食性高度分化。本研究旨在通过建立七星瓢虫Coccinella septempunctata触角转录组数据库,探讨其触角嗅觉相关基因与食性分化的关系。【方法】采用Illumina HiSeq 4000高通量测序平台对七星瓢虫成虫触角转录组进行测序、组装、注释,挖掘嗅觉相关基因,并与已发表的茄二十八星瓢虫Henosepilachna viginyioctopunctata转录组进行比较。【结果】共获得七星瓢虫触角转录组31 775条unigenes,其中69.71%的序列得以注释,NR数据库中注释最多,为20 539条。据注释信息,挖掘到27个嗅觉相关基因,包括1个气味结合蛋白(odorant binding protein, OBP)基因,13个化学感受蛋白(chemosensory protein, CSP)基因,4个气味受体(odorant receptor, OR)基因,7个味觉受体(gustatory receptor, GR)基因和2个感觉神经元膜蛋白(sensory neuron membrane protein, SNMP)基因。相对应地,在植食性茄二十八星瓢虫转录组中鉴定到38个嗅觉相关基因,包括七星瓢虫中未发现的1个离子型受体(ionotropic receptor, IR)基因。在各类型嗅觉相关基因中,茄二十八星瓢虫转录组的OBP基因比例(13.16%)高于七星瓢虫触角转录组的(3.70%),而七星瓢虫触角转录组的GR基因比例(25.93%)则高于茄二十八星瓢虫转录组的(13.16%)。【结论】触角嗅觉相关基因数目不是昆虫食性分化的主因。本研究获得了七星瓢虫触角转录组学资源,初步探讨了嗅觉相关基因同瓢虫食性分化的关系,为了解瓢虫乃至昆虫食性分化的分子基础提供了信息。     

滇池金线鲃肠道产细菌素细菌的筛选鉴定及细菌素LSP01的抑菌作用

【背景】细菌素是微生物在生长过程中产生的一类具有抑菌作用的蛋白质或多肽类物质,可有效抑制或杀灭多种病原微生物。滇池金线鲃(Sinocyclocheilusgrahami)是云南滇池特有鱼种,长期生存在滇池恶劣的生态环境中,其肠道内可能存在着大量产细菌素的微生物资源。【目的】从滇池金线鲃肠道内筛选产细菌素菌株,并对其所产细菌素的抑菌特性及机制进行探究。【方法】对滇池金线鲃肠道细菌进行分离鉴定,利用牛津杯双层平板法筛选具有抑菌活性的产细菌素菌株,测定抑菌活性最佳菌株的细菌素酶敏感性、酸碱与高温耐受性、最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration, MIC)与抑菌广谱性等抑菌特性,并借助细胞膜通透性、 2,3-bis(2-methoxy-4-nitro-5-sulfonyl)-2h-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT)实验及扫描电子显微镜(scanning electronmicroscope,SEM)观察等实验探究细菌素的抑菌机制。【结果】从滇池金线鲃肠道中共筛选得到5株产细菌素细菌,隶属于芽孢杆菌属(Bacillus)和乳杆...     

抑制嗜水气单胞菌乳酸菌的筛选、鉴定及抑菌作用

从健康成年尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）肠道中分离纯化得到乳酸菌,采用牛津杯双层平板法筛选具有抑制嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)活性的乳酸菌菌株,借助16S rRNA分子鉴定乳酸菌种类。通过排除有机酸和过氧化氢干扰及蛋白酶敏感性等试验分析抑菌活性最佳乳酸菌的抑菌活性物质成分,并进行热、酸碱稳定性和扫描电镜观察等确定抑菌活性物质对嗜水气单胞菌的抑菌作用。结果显示,尼罗罗非鱼肠道中有3株乳酸菌对嗜水气单胞菌表现出良好的抑菌效果,经鉴定后分别为植物乳酸菌（Lactobacillus plantarum）和唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius）。其中,菌株LX3的抑菌活性最佳,抑菌圈直径可达到（25.25±0.23） mm且对多种蛋白酶敏感,经不同温度和酸碱性处理后抑菌活性物质仍保持较高的抑菌活性,特别是在pH 12和100 ℃处理后,抑菌圈直径仍达到（13.87±0.12）和（16.65±0.26） mm。此外,扫描电镜观察发现菌株LX3抑菌活性物质主要破坏了嗜水气单胞菌的细胞结构,使细胞内容物流出,致其死亡。上述结果表明,尼罗罗非鱼肠道中拥有较为丰富的抑制嗜水气单胞菌乳酸菌资源,尤其是菌株LX3显示出良好的抑菌活性与抑菌作用,这对于替代抗生素防治嗜水气单胞菌引发的相关鱼类疾病具有重要价值。     

复合噬菌体裂解酶对白羽肉鸡肠道菌群结构和肝脏抗氧化酶指标的影响

【背景】噬菌体裂解酶具有良好的安全性与抑菌特性,有望替代抗生素作为一种饲料添加剂应用于改善畜禽肠道菌群和预防动物疾病。【目的】以白羽肉鸡为饲喂对象,分别饲喂复合噬菌体裂解酶与抗生素制剂,评估噬菌体裂解酶对畜禽肠道菌群的影响及其作为替抗饲料添加剂的应用潜能。【方法】以3日龄健康白羽肉鸡为饲喂对象,在基础饲粮上添加由噬菌体裂解酶TSPphg和噬菌体裂解酶MMPphg获得的复合噬菌体裂解酶制剂(200 mg/kg)与50μg/g的金霉素制剂,分别进行比较饲喂管理。利用第三代测序技术对28 d时白羽肉鸡肠道菌群进行高通量测序,借助生物信息学分析肠道菌群多样性和优势菌群(丰度前10)相对丰度,揭示各分组组间与组内差异,并对肝脏主要氧化酶活性进一步比较。【结果】饲喂复合噬菌体裂解酶和金霉素制剂对白羽肉鸡肠道菌群有一定影响,均降低了肠道菌群相对丰度与多样性,而且Shannon指数与空白组相比存在显著差异(P0.05)。优势菌群中,复合噬菌体裂解酶组相较于金霉素组和空白组,拟杆菌门的相对丰度发生了显著上升,而厚壁菌门的相对丰度发生了显著下降(P0.05)。同时,在属水平上,粪杆菌属的相对丰度发生了显著上升,而螺杆菌属的相对丰度发生了显著下降(P0.05),这一趋势与多数替代抗生素产品饲喂家禽后肠道菌群变化趋势类似,更有利于家禽肠道的健康。此外,饲喂复合噬菌体裂解酶组相较于金霉素组和空白组,过氧化氢酶(Catalase,CAT)和超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)活性均发生了显著上升(P0.05)。【结论】噬菌体裂解酶能够有效改善畜禽肠道菌群,促进畜禽肠道菌群的微生态健康及提高机体免疫力,将噬菌体裂解酶替代抗生素应用于畜禽养殖具有较好的前景,值得进一步研究。     

一株福氏志贺氏菌噬菌体的分离鉴定及其生物学特性

【背景】志贺氏菌是一类能引起人和动物腹泻的致病菌,由于抗生素滥用导致其耐药问题日益严重,寻找新的抗菌药物和治疗方法成为目前亟待解决的问题。【目的】检测志贺氏菌对肉鸡的致病性,分离纯化出一株可裂解强致病性志贺氏菌的噬菌体,并对其生物学特性进行研究。【方法】从病鸡肠道黏膜分离志贺氏菌;以健康肉鸡为动物模型进行攻毒,测定强致病性菌株的耐药性;并以此为宿主菌分离噬菌体,聚乙二醇(Polyethylene Glycol,PEG)沉淀法纯化浓缩噬菌体后,用透射电子显微镜观察其形态特征。利用双层平板法测定噬菌体的宿主谱、最佳感染复数、一步生长曲线、pH和热稳定性对噬菌体活性的影响。【结果】分离得到26株志贺氏菌,分别命名为BDS1-BDS26,其中BDS8致病性最强,经鉴定属于福氏志贺氏菌,而且存在多重耐药性,灌喂后的肉鸡出现严重腹泻和血便;解剖病症主要表现为心脏肥大、肠系膜出血明显等。以BDS8为宿主菌,分离得到噬菌体ΦDS8。透射电镜结果显示噬菌体ΦDS8的头部呈二十面体形状,直径61±2 nm,尾长165±2 nm,属长尾噬菌体科。噬菌体ΦDS8在pH 4.0-10.0、50℃以下范围内能保持较高活性,感染周期约为120 min,其中包括75 min的潜伏期和45 min的暴发期,暴发量为52 PFU/cell。【结论】噬菌体ΦDS8具有宿主特异性,在常规环境下具有较好的耐受能力,为噬菌体治疗福氏志贺氏菌病提供理论依据。     

二甲酸钾对白羽肉鸡生长性能和肠道菌群结构的影响

为评估二甲酸钾对畜禽肠道菌群的影响及其作为一种抗饲料添加剂的应用潜力,采用3日龄健康白羽肉鸡作为饲喂对象,在基础饲粮基础上添加质量浓度为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%的二甲酸钾和含量为50 mg/mL的金霉素分别进行比较饲喂管理。记录28 d试验周期内白羽肉鸡的料重比变化,采集28 d时白羽肉鸡盲肠肠道内溶物,利用第三代测序技术对肠道菌群进行16S rDNA全长序列高通量测序。结果显示,饲喂0.3%的二甲酸钾能够显著降低料重比,对白羽肉鸡的生长性能具有明显的促进作用。饲喂0.3%的二甲酸钾对白羽肉鸡的肠道菌群结构造成了一定的影响,有效地提高了肠道菌群的物种多样性。优势菌群中,饲喂0.3%二甲酸钾与空白组相比,在门水平上,拟杆菌门相对丰度显著上升,厚壁菌门、变形菌门和Epsilonbacteraeota的相对丰度下降,产生了更有利于生长发育的微生物群落。同时,在属水平上,拟杆菌属相对丰度显著上升, Barnesiella和螺杆菌属的相对丰度下降,改善了肠道中微生物菌群的微生态健康。研究结果丰富了二甲酸钾和金霉素对白羽肉鸡生长性能和肠道菌群影响的认识,也为更全面了解二甲酸钾应用于替代抗生素对畜禽的影响提供了有价值的微生物学信息。