共表达H5N1流感病毒M1和HA基因的DNA疫苗与腺病毒载体疫苗的小鼠免疫评价

为评价在小鼠体内表达流感病毒M1和HA基因诱导的免疫反应,制备共表达H5N1亚型禽流感病毒 (A/Anhui/1/2005) 全长基质蛋白1 (M1) 基因和血凝素 (HA) 基因的重组DNA疫苗pStar-M1/HA和重组腺病毒载体疫苗Ad-M1/HA,将其按初免-加强程序免疫BALB/c小鼠,共免疫4次,每次间隔14 d。第1、3次用DNA疫苗,第2、4次用重组腺病毒载体疫苗,每次免疫前及末次免疫后14 d采集小鼠血清用于检测体液免疫应答,末次免疫后14 d采集小鼠脾淋巴细胞用于检测细胞免疫应答。血凝     

应用反向遗传学技术在哺乳动物细胞中产生甲型流感病毒

在国内首次应用反向遗传学技术将多个质粒共转染哺乳动物细胞,得到了具有活性的甲型流感病毒.采用自行构建的含有polⅠ和polⅡ启动子和终止子序列的pIVV2质粒,将A/PR/8/34(H1N1)流感病毒基因组全部8个RNA节段的cDNA分别克隆到该质粒的两个启动子之间,得到了8个可在真核细胞中复制和表达的质粒.将这8个质粒共转染293T细胞,培养48h后吸取上清液,转接入MDCK细胞中,再经过72h培养,发现在MDCK细胞中有明显的流感样细胞病变产生,测上清病毒血凝滴度为1:10.将MDCK细胞冻融液继续接种鸡胚和MDCK细胞,培养后将鸡胚尿囊液和MDCK细胞冻融上清液进行血凝和血凝抑制实验,证明所得病毒为A/PR/8/34(H1N1).此结果将有助于国内今后对流感疫苗的研究.     

应用酵母双杂交系统筛选与CIKS(151-574)相互作用的蛋白质

CIKS(ConnectiontoIKKandSAPK JNK)是最近发现的细胞蛋白 ,能激活IKK和SAPK JNK。应用酵母双杂交系统 ,将CIKS(15 1 5 74)插入载体pAS2 1作为诱铒 ,筛选人HeLa细胞MATCHMAKERcDNA文库 ,以期为阐明NFκB及JNK活性调控的分子机理提供新的线索。筛选得到 6个阳性AD 文库质粒 ,并用酵母双杂交实验验证了阳性AD 文库质粒与CIKS的相互作用。将阳性AD 文库质粒测序并对测序结果做BLAST分析 ,发现它们分别是RIKENcDNA 473340F0 3,PLAC8,CD2 7BP (Siva 1) ,CDC5L ,SnRNPsmB ,DVL2。CIKS能与这些功能各异的蛋白质相互作用 ,表明CIKS在细胞的多种生理活动中发挥作用。     

人γ干扰素突变体(rIFN-γ132-PGIL)的构建及其生物学活性的测定

利用DNA重组技术,去掉人γ干扰素(IFNγ)基因3′端含编码多肽羧基(C)端11个氨基酸的核苷酸序列,与编码P,G,I,L的DNA序列相连接,构成IFNγ突变体(rIFN-γ132-PGIL)基因,将后者插入pBV220P_RP_L串连启动子下游,转化大肠杆菌DH5α,在CIts857基因的调节下,通过升温诱导,获得了高效表达,表达量约占菌体可溶性蛋白的30％以上,抗病毒活性平均可达4.9×10~-8U/L,比母体菌株高10倍。SDS—PAGE结果表明,rIFN-γ132—PGIL分子量为17kd。     

利用酵母双杂交系统研究人血管内皮生长因子受体Flt-1的配体结合域

The vascular endothelial growth factor (VEGF) receptor Flt-1 is charaterized by seven Ig-like loops within the extracellular domain. To identify which part is responsible for ligand binding, four cDNA clones coding for truncated Flt-1 mutants consisting of loop 1, 1-2, 2-3 and 1-3 were obtained by PCR from human cardiac cDNA library and inserted into the vectors of the yeast two-hybrid system, with VEGF cDNA on the partner plasmid. The paired plasmids were transformed into yeast strain SFY526, and tested by filter membrane method and β-galactosidase activity. The results showed that Flt-1(1-2)、Flt-1(2-3) and Flt-1(1-3) all were able to bind VEGF, of which Flt-1(1-3) showed the highest binding affinity, but no binding of VEGF was observed with Flt-1(2) and VEGF.     

应用硫氧还蛋白促进外源蛋白在大肠杆菌的可溶性表达

为了观察硫氧还蛋白（ＴｒｘＡ）促进外源蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的作用,我们从质粒ｐＥＴ－３２ａ（＋）上克隆了ｔｒｘＡ基因,构建了ＴｒｘＡ表达质粒ｐＴ－ＴｒｘＡ。将该质粒与其它蛋白基因的表达质粒共同转化Ｅ．ｃｏｌｉ并同时获得表达。结果表明,共表达ＴｒｘＡ可以明显促进外源蛋白,如甲状旁腺激素相关蛋白（ＰＴＨｒＰ）、ＰＴＨｒＰ受体（ＰＴＨｒＰ－Ｒ）的血管内皮生长因子（ＶＥＧＦ）的可溶性表达。说明共表达     

一种重组人α1型干扰素突变体IFN-α1/86D的纯化与鉴定

本文研究了重组人α1型干扰素突变体IFN-α1/86D在摇瓶培养和分批发酵培养的重组大肠杆菌DH5α株中的表达动态,并采用阳离子交换层析和抗α1型干扰素单克隆抗体亲和层析的两步流程对其进行了纯化,得到SDS-PAGE纯及高效液相层析(HPLC)纯的IFN-α1/86D产品,共比活性为2.3×10~7单位/毫克蛋白。N端氨基酸序列测定的结果表明,纯化产品的纯度在95％以上,但其N端不均一,产品中含有两种N端序列正确的IFN-α1/86D活性分子,即约75％为去Met分子和约25％为带Met分子。     

人H5N1亚型禽流感病毒安徽株NS1基因的克隆及在原核系统的表达

利用RT-PCR方法,从人H5N1亚型禽流感病毒安徽株扩增到了NS1基因,对其进行了克隆、序列测定和分析,并在原核系统高效表达和纯化了NS1蛋白。进化分析表明,A/Anhui/01/2005毒株与近些年国内分离的水禽H5N1病毒进化关系更为接近。NS1与福建、湖南分离的禽流感病毒同源性最高,分别达到99.1%和98.2%。序列分析表明,与病毒的致病性相关的92位氨基酸为Asp,与病毒的细胞因子抗性相关的80~84位氨基酸发生缺失,与断裂/多聚腺苷酸化特异性因子结合的基序改变为GFEWN,和病毒致死性相关的PL基序为ESEV。随后在大肠杆菌高效表达并纯化了NS1蛋白。NS1基因及其编码产物的特性分析以及在原核系统的表达,为进一步研究NS1的致病机制和抗病毒药物研制奠定了基础。