力生长因子在大肠杆菌中的表达及活性分析

MGF(Mechano-growth factor)是一种IGF-1变体形式, 研究发现该因子具有应力敏感性, 并且具有促进肌肉肥大、再生以及神经损伤修复的功能。通过RT-PCR从拉伸刺激的人成骨细胞中克隆MGF cDNA序列, 并去除5'端9 bp的序列, 使N端缺少对肠激酶(Enterokinase, EK)具有抑制作用的脯氨酸, 将截短型MGF (des(1-3) MGF) cDNA序列克隆入pET32a(+)质粒, 构建重组表达质粒。重组质粒转化E. coli BL21(DE3), 在30oC培养下以可溶形式表达融合蛋白Trx/ des(1-3)MGF, 采用离子交换层析和Ni2+金属亲和层析, 获得纯度95%以上的融合蛋白。再对融合蛋白EK酶切, rpHPLC分离获得纯度达98%的des(1-3)MGF, SDS-PAGE电泳及质谱分析蛋白分子量与理论值相符。生物活性实验显示, 所制备的des(1-3)MGF比des(1-3)IGF-1更显著的促进MC3T3-E1细胞的增值和迁移。     

流体剪应力对成骨细胞OPG和ODF表达的影响

通过平板流动腔装置对大鼠成骨细胞施以流体剪应力,研究剪应力作用对成骨细胞中骨保护因子(osteoprotegerin,OPG),破骨细胞分化因子(osteoclast differentiation factor,ODF)基因表达的影响.分别考察了剪应力大小和作用时间,以及单一水平和梯度变化的剪切力加载方式的影响.运用RT-PCR和蛋白质印迹技术检测OPG、ODFmRNA和蛋白质表达的变化,结果显示,剪切力作用下OPG的表达得到促进,ODF的表达受到抑制,mRNA与蛋白质表达的变化一致,这种影响与剪切力的大小和作用时间有关.1.0和1.5N/m2的剪应力作用效果比0.5N/m2明显,梯度变化的作用方式在作用效果上与最后一个梯度水平相当的恒定剪应力单独作用没有显著差异,在加载的24h内剪应力对OPG、ODF表达的影响始终存在.这种影响使得OPG/ODF的平衡向着OPG占优的方向发展,这种变化意味着骨吸收会受到抑制,提示力学刺激可能通过OPG/ODF调控系统对骨代谢平衡进行调控.     

力生长因子E肽对成骨细胞增殖及基因表达的影响

为了探索力生长因子羧基端E结构域的后24个氨基酸组成的短肽(MGF-Ct24E)对成骨细胞生物学活性的影响,通过组织块培养法获得大鼠原代成骨细胞,采用MTT法和流式细胞仪检测细胞的增殖及细胞周期分布情况,基因芯片技术检测细胞基因表达谱,并用定量PCR实验验证芯片检测结果。结果显示MGF-Ct24E组的细胞增殖活性明显高于对照组,且在培养第一天促增殖效果最为显著。细胞周期结果显示MGF-Ct24E显著提高了S期和G2/M期的细胞所占比例。基因芯片检测发现差异表达基因共1397个,其中上调922,下调475,且差异表达的基因主要是关于细胞的增殖分化调节,生长因子结合和活性调节等方面。MGF-Ct24E对成骨细胞的这种增殖分化调控提示MGF-Ct24E在促进骨修复方面有着潜在的应用价值。     

提高哺乳动物工程细胞抗凋亡能力的基因策略

利用哺乳动物细胞发酵生产重组蛋白药物具有细菌、酵母等表达系统所不具备的显著优势,因此在生物制药工程中的重要性越来越突出。哺乳动物细胞对工业生产环境下的各种应激环境耐受能力差,易发生细胞凋亡,严重阻碍了大规模生产,降低了生产效率。细胞凋亡是细胞必经的生物学过程,随着对凋亡机制的深入了解,发展出各种抗凋亡策略,并有望应用于重构更适合工业生产的工程细胞。常用的抗凋亡策略包括:下调凋亡蛋白、上调抗凋亡蛋白、增强生长因子自表达、减少有毒代谢产物生成等。以上策略虽然能在一定程度上提高细胞的抗凋亡能力,但距离满足生产的工程细胞重构还有距离,围绕提高工程细胞的抗凋亡能力,已发展出"凋亡工程"这一重要的技术领域。     

拉伸刺激下MGF在成骨细胞中的表达及亚细胞定位分析

力生长因子（mechano-growth factor,MGF）是在成肌细胞中发现的一种对拉伸刺激敏感的生长因子,该生长因子也可能在其他的力效应细胞中由力学刺激产生.通过设计细胞拉伸装置,对成骨细胞施加不同时段的周期性动态拉伸刺激.定量分析mRNA和蛋白质表达显示,周期性拉伸刺激下成骨细胞中的MGF mRNA和蛋白质水平快速提高,mRNA的水平在加载6h达到最高峰,与静态对照组相比提高5倍,而MGF的蛋白表达需要加载12h达到最高,与对照相比提高了5.2倍,随后二者分别降低,在24h达到本底水平.荧光免疫细胞化学技术检验MGF在细胞中的分布发现,MGF具有核分布的特点.因此得出结论,周期性拉伸刺激能刺激成骨细胞快速表达,MGF核分布的特点暗示MGF可能是一种自分泌作用因子.     

力生长因子及其E肽对成骨细胞分化的影响

力生长因子(mechano growth factor,MGF)是新近发现的一种生长因子,由Igf-1基因剪接变异产生,拉伸刺激会促使成骨细胞表达力生长因子.比较分析了MGF及其羧基端E肽(MGF-Ct24E)对成骨细胞前体细胞MC3T3-E1分化的影响.结果显示:MGF和MGF-Ct24E具有显著激活胞外信号调节激酶1/2(Erk1/2)的作用,并降低了成骨细胞碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原的表达,促进了骨桥蛋白(OPN)的表达,减少了核心绑定因子(corebinding factor1,Cbfα-1)的核转运量,对成骨细胞的分化具有延迟效应,这种效应通过抑制剂PD98059抑制Erk1/2的活化得到逆转;MGF还能显著激活磷脂酰肌醇3-激酶信号通路中的蛋白激酶B(Akt),该活化作用对成骨细胞分化是必需的,钙沉积分析显示长期培养下的细胞MGF促进了矿化节结的形成.这些结果说明,MGF-Ct24E对成骨细胞的分化具有抑制作用,这种作用与Erk1/2的活化有关,MGF因为包含E肽和IGF-1部分,能分别激活Erk1/2和Akt,因此对成骨细胞分化表现出双重效用,在成骨细胞分化早期,具有一定的延迟效应,而在分化晚期对成骨...     

参芪扶正注射液联合索拉非尼对晚期原发性肝癌的疗效及对患者VEGF、TNF-α、IFN-γ水平的影响

摘要 目的：探讨参芪扶正注射液联合索拉非尼(SOR)治疗晚期原发性肝癌(PLC)的临床效果及对患者血管内皮生长因子（VEGF）、肿瘤坏死因子(TNF)-α、γ-干扰素(IFN-γ)水平的影响。方法：选取我院2015年3月~2017年3月收治的116例晚期PLC患者,采取随机数字表法均分为两组。对照组采取SOR进行分子靶向治疗,观察组在此基础上加用参芪扶正注射液辅助治疗。比较两组的临床疗效,治疗前后VEGF、TNF-α、IFN-γ水平的变化及不良反应的发生情况。结果：治疗3个月后,观察组临床获益率与有效率分别为81.0%、39.7%,较对照组(63.8%、20.7%,P<0.05)均明显上升。两组血清VEGF随治疗时间的延长而逐渐下降（P<0.01）,且观察组治疗1、3个月后的VEGF低于对照组同期（P<0.05）;两组血清TNF-α、IFN-γ水平均随治疗时间的延长而逐渐升高(P<0.01);且与对照组同期相比,观察组治疗1、3个月后以上指标均显著更高(P<0.01)。观察组不良反应率为43.1%,与对照组(62.1%)比较明显降低(P<0.05)。结论：参芪扶正注射液联合索拉非尼治疗晚期原发性肝癌的疗效显著,可能与其显著改善血清中VEGF、TNF-α、IFN-γ水平有关,同时其减毒效果较佳,可作为晚期原发性肝癌临床治疗的一种较为理想的用药方案。