过氧化氢酶基因在大肠杆菌中的克隆表达及发酵优化

利用PCR扩增技术得到枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)过氧化氢酶基因katA,将该基因与表达载体pET-20b(+)连接构建重组质粒,经测序验证后,在大肠杆菌JM109中进行表达得到重组大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)(pET-20b(+)-katA).SDS-PAGE电泳结果显示出...     

添加CTAB促进吸水链霉菌产谷氨酰胺转胺酶

研究了添加十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)对吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)合成谷氨酰胺转胺酶的影响。结果表明,添加CTAB可以提高发酵过程中谷氨酰胺转胺酶的酶活,摇瓶培养中,CTAB的最佳添加时间和添加量分别为32h和1%,发酵终了时,谷氨酰胺转胺酶酶活最高达5.04u/mL,比对照提高了21.8%。初步研究表明,CTAB的主要作用是促使谷氨酰胺转胺酶的酶原转化为成熟酶,因此,在发酵过程中添加适当浓度的CTAB,可使酶原快速、完全地转化为成熟的MTG,解除酶原的产物抑制作用,促进了细胞产酶。     

大气压辉光放电低温等离子体诱变选育谷氨酰胺转胺酶高产菌株

以茂源链轮丝菌(Streptoverticillium mobaraense)03-10为出发菌株,采用一种新型的裸露电极大气压辉光放电的冷等离子体技术对链霉菌孢子进行诱变。根据双层平板法菌落显色及诱变处理后菌落形态差异快速筛选谷氨酰胺转胺酶高产突变株。突变率、正突变率分别达到42.8%和20.6%。最后复筛选育出具有较好遗传稳定性和形态稳定性的高产突变株G2-1,酶活达到2.73U/mL,比出发菌株提高了82%。     

Streptomyces hygroscopicus谷氨酰胺转胺酶酶原基因的鉴定及在大肠杆菌中的表达

[目的]鉴定来源于吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因;研究其在大肠杆菌系统的克隆与表达;分析该酶与其同源酶的活性中心氨基酸序列.[方法]从本实验室筛选的吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus;CCTCC M203062)发酵液中,分离纯化得到谷氨酰胺转胺酶酶原(pro-MTGase),测得N-端前十个氨基酸序列并与其它链霉菌来源的相应基因序列比较设计引物,扩增得到pro-MTGase 基因,将该基因插入到表达载体pET-20b( )信号肽pelB下游,构建分泌型表达载体pET/pro-MTG,并转化不同的大肠杆菌宿主BL21(DE3)和Rosetta(DE3)pLysS.[结果]获得了pro-MTGase的完整基因序列,多重碱基序列比对表明其与S.platensis和S.caniferus的pro-MTGase基因同源性高达92%.利用Rosetta(DE3)pLysS通过降温至24℃诱导策略,获得部分胞外表达的酶原.SDS-PAGE显示,胞外表达重组蛋白的分子量约为44kDa,与吸水链霉菌表达的天然酶原相符.诱导4 h后发酵液中的重组酶原经胰蛋白酶活化为成熟酶后测得最高酶活为0.24U/mL.[结论]该研究是对吸水链霉菌的谷氨酰胺转胺酶基因的首次报道,也是国内首次利用大肠杆菌实现pro-MTGase的胞外可溶性表达.     

吸水链霉菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶的补料研究

在吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)分批发酵研究的基础上,通过在菌体生长阶段指数流加葡萄糖,进行高细胞密度培养,获得了较高的菌体量;待菌体生长进入产酶期后,通过补加氮源,为产酶提供充足的氮源,其中通过流加蛋白质氮源,可以减少蛋白酶对成熟MTG的分解,促进产酶。结果表明,8~16 h采用较高的的比生长速率(0.15 h-1),后期降低比生长速率(0.10 h-1),此时得到的菌体量较高,可达到36 g/L,比分批发酵下的菌体量提高了80%。同时在培养基中添加50g/L的豆饼粉,最终酶活可达到5.79U/ml,提高了83%。     

混合碳源流加对重组毕赤酵母生产碱性果胶酶的影响

为提高重组毕赤酵母生产碱性果胶酶(PGL)的产量和生产强度,在诱导期采用多种碳源与甲醇混合添加的模式。实验结果发现:甘油、山梨醇、乳酸与甲醇的混合添加均可以提高PGL的产量,其中山梨醇与甲醇的混合流加效果最为显著。研究表明,通过双碳源混合流加可以提高细胞活力,增强醇氧化酶活力,提高毕赤酵母表达外源蛋白效率。当山梨醇的流速为3.6g/(h·L)时,PGL酶活可达1593U/mL,生产强度为16.7U/(mL·h),比对照分别提高了84.6%和45.2%,实现了碱性果胶酶的高效生产。     

碱性果胶酶的生物制造及其在纺织工业清洁生产中的应用研究进展

以下综述了碱性果胶酶的生物制造及其在纺织工业清洁生产中的应用研究进展。微生物发酵法是目前生产碱性果胶酶的主要方式,枯草芽孢杆菌是碱性果胶酶工业发酵生产中效果较好的野生菌株。影响发酵法生产碱性果胶酶的主要因素有:底物浓度及其流加方式、细胞浓度、搅拌转速、通气速率、pH、温度等。构建基因工程菌为碱性果胶酶的发酵生产开辟了一条有效途径,其中重组毕赤酵母的产酶水平最高,在10吨发酵罐上酶活达1305U/mL。碱性果胶酶可用于棉织物前处理的精练工艺,与传统高温碱煮相比,具有保护纤维、提高精练效率、降低能耗和污染的优势。通过分子定向进化技术对碱性果胶酶进行分子改造,使其催化特性更加适合于纺织精练工艺,进而实现纺织工业的清洁生产是未来的研究重点和热点。     

生物法脱除木质纤维素水解液中抑制因子的最新研究进展

实现从木质纤维素原料到燃料和高附加值化学品的生物转化,预处理是一个非常重要的步骤.酸解或蒸汽爆破等热-化学预处理过程会在水解液中生成或释放有机酸类、糠醛类和酚类化合物等抑制因子.这些抑制因子对发酵微生物具有毒性,会显著降低发酵产品的产率和生产强度.生物法去除木质纤维素水解液中的抑制因子具有操作简便以及不产生废水、废物等优点.生物脱毒法可分为两类:一类是通过向木质纤维素水解液中添加微生物或酶制剂,在发酵前去除抑制因子;另一类方法是通过遗传改造或适应性进化提高发酵菌株对抑制因子的生物降解能力,从而提高木质纤维素水解液的发酵性能.将着重以乙醇生产为例,介绍如何通过生物脱毒的方法提高木质纤维素水解液发酵的得率和生产强度.     

两种植绥螨的同类相残和集团内捕食作用

巴氏新小绥螨(Neoseiulus barkeri)和黄瓜新小绥螨(N.cucumeris)是两种多食性植绥螨,主要捕食叶螨和蓟马等,目前在我国广泛应用于农业生物防治中.本文研究了这两种植绥螨种内的同类相残(cannibalism)和种间的集团内捕食作用(intraguild predation)以及相互之间的攻击强度,以明确两者之间的相互关系,为合理构建天敌组合及评估生物防治的作用提供依据.结果显示:两种植绥螨对同种或异种幼螨的捕食量最大,其次是若螨,而对卵的捕食量极低.两种植绥螨对异种幼螨或若螨的捕食量均极显著高于对同种幼螨或若螨的捕食量.可见,无其他猎物存在情况下,两种植绥螨同时发生时更倾向于发生种间的集团内捕食.而巴氏新小绥螨对异种幼螨或若螨的捕食量均高于黄瓜新小绥螨对异种幼螨或若螨的捕食量,并且巴氏新小绥螨和黄瓜新小绥螨相比,巴氏新小绥螨对异种幼螨的攻击性更强,因此当这两种植绥螨发生集团内捕食时,巴氏新小绥螨是潜在的集团内捕食者,而黄瓜新小绥螨是潜在的集团内猎物.