白蚁内切-β—1，4-葡聚糖酶基因的克隆、表达、纯化及酶学性质的研究

提取了台湾家白蚁总RNA并反转录获得eDNA,PCR扩增出白蚁内切葡聚糖酶的基因,并将目的基因分别克隆到大肠杆菌和酿酒酵母载体中,构建了产内切-β-1,4-葡聚糖酶的基因工程菌。由于大肠杆菌会有少量的泄漏表达,而所用的酿酒酵母表达载体是本实验室构建带有INU信号肽的表达载体,故都可采用刚果红平板染色法筛选具有羧甲基纤维素酶（CMCase）活性的重组转化子。利用金属镍亲和层析对大肠杆菌表达的内切-β-1,4-葡聚糖酶进行纯化,CMC酶活检测显示纯化酶的最适温度和最适pH值分别为42℃、6．5;内切-β-1,4-葡聚糖酶的Vmax为0．071mg／mL·min,Km值为80．2712mg／mL。     

马克斯克鲁维酵母GX-UN120糖转运蛋白基因的克隆及表征

【背景】马克斯克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)具有完整的木糖代谢途径,可以高效利用木质纤维素中的木糖,因此对其糖转运蛋白基因的研究或可有效解决酵母木糖转运的相关问题。【目的】根据马克斯克鲁维酵母DMKU3-1042中KLMA＿70145和KLMA＿80101基因位点的功能预测,获得马克斯克鲁维酵母GX-UN120相应的糖转运蛋白基因序列并探究其功能。【方法】将转运蛋白基因分别克隆表达至酿酒酵母EBY.VW4000中考察重组菌株生长特性,以此间接评价对应转运蛋白的转运能力。【结果】Km＿SUT2基因编码的糖转运蛋白可有效提高宿主细胞转运木糖、阿拉伯糖、山梨糖、核糖、乳糖和葡萄糖的能力,但却不能转运甘露糖、果糖、蔗糖和半乳糖。类似地,Km＿SUT3基因编码的糖转运蛋白可提高细胞转运木糖、阿拉伯糖、山梨糖、半乳糖、核糖、乳糖和葡萄糖的能力,但却不能转运甘露糖和果糖。然而在葡萄糖存在的条件下,重组菌株对各种碳源的利用均受抑制,但Km＿SUT3转运木糖和核糖过程中受葡萄糖的抑制作用较小。【结论】马克斯克鲁维酵母GX-UN120中转运蛋白Km＿SUT2和Km＿SUT3可...     

一株产常温葡甘聚糖酶的芽孢杆菌的分离、鉴定及产酶发酵条件的研究

以魔芋生粉为唯一碳源的筛选培养基,从魔芋废渣中分离筛选出一株可以降解魔芋生粉的细菌菌株,编号为LS-6。根据16SrDNA序列和生理生化特性,将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。胞内外葡甘露聚糖酶酶活分析结果表明,LS-6产生的葡甘聚糖酶为胞外酶。LS-6产生葡甘聚糖酶的最佳培养基组分和条件是:1%魔芋生粉,0.5%酵母粉,0.5%NaCl,培养基初始pH为6.0,最佳发酵条件是25℃,摇床转速200r/min,培养48h。酶解产物的高效液相色谱分析结果表明,LS-6粗酶液的酶解产物主要为葡萄糖和甘露糖。LS-6的分离为进一步克隆常温葡甘聚糖酶基因和产酶工程菌的构建奠定了基础。     

大肠杆菌甘油激酶基因(glpK)和甘油脱氢酶基因(gldA)的敲除及其对甘油产量的影响

利用Red重组系统构建了大肠杆菌JM109甘油激酶基因(glpK)和甘油脱氢酶基因(gldA)缺失的双突变菌株JM109B,然后将表达酿酒酵母3-磷酸甘油脱氢酶基因(GPD1)和3-磷酸甘油酯酶基因(HOR2)的质粒pSE-gpd1-hor2转化到JM109B突变菌株中,在含1%葡萄糖的摇瓶发酵培养基中37℃发酵24 h,甘油的最高产量为5.61 g/L,是原始菌株JM109/pSE-gpd1-hor2甘油产量的1.59倍;在30 L发酵罐中发酵28 h,甘油的最高产量为103.12 g/L,是原始菌株JM109/pSE-gpd1-hor2甘油产量的1.59倍,是原始菌株BL21/pSE-gpd1-hor2甘油产量的1.41倍,葡萄糖转化率为50.39%。     

产3-脱氧葡糖醛酮代谢酶微生物的研究*

从海洋细菌中筛选到一株产３－脱氧葡糖醛酮代谢酶活力较高的菌株Ｆｓ－４—Ｃ－３,并对其进行了最适产酶条件的研究。实验证明：以鱼肉蛋白胨为氮源、蔗糖为碳源,在培养基起始ｐＨ值为７．８～８．０,温度为２８℃,盐度为５％的情况下,培养９６ｈ,产酶最高。３－ＤＧ可以诱导产酶。     

绿色木霉葡聚糖内切酶EGIII基因在大肠肝菌中的表达、定点突变及其动力学特性的研究

将绿色木霉葡聚糖内切酶EGIII基因亚克隆到表达载体pET-22b(+),构建重组质粒pET-egl3,转化到大肠杆菌BL21(DE3).利用金属亲和层析对重组EGIII进行纯化,纯化后酶比活力达到6 U/mg蛋白,最适反应温度为60 ℃,最适pH为4.0.同时对EGIII催化区的氨基酸残基R130和E218进行定点饱和突变,各筛选到一株酶活有提高的突变子R130P和E218F,其比活力为野生型EGIII的2.8倍和3.45倍.突变酶E218F的Km提高了一倍,催化效率Kcat提高了5.4倍;而R130P的Km和Kcat没有明显变化.两个突变酶的最适酶解温度和pH分别都提高至65 ℃和4.4.     

台湾家白蚁内切葡聚糖酶活性中心氨基酸的饱和突变

对内切葡聚糖酶的功能改进一直是纤维素酶研究领域的焦点。本研究对台湾家白蚁内切葡聚糖酶(CfEG)的活性位点做了饱和突变。首先,以PDB数据库中高山象白蚁内切葡聚糖酶(NtEG)的三维结构(PDB id=1ks8)为模板,对CfEG进行三维结构同源建模,二者序列一致性高达79%。位于CfEG活性中心的D53、D56、E411,分别与NtEG的催化残基D54、D57、E412重合。用简并引物对CfEG的假定活性位点D53、D56、E411进行定点饱和突变。在位点D53、D56各筛选到羧甲基纤维素酶活有一定提高的突变子D53E、D56C,其中D56C的Km值减小为原始酶的三分之一。双突变子D53L/D56I的比活比原始酶提高了近2倍,同时Km值减小至原始酶的一半。而E411的饱和突变子库均没有活性,进一步将其替换为近似氨基酸的E411D、E411Q定点突变子也丧失了酶活。由突变结果可推断,位点E411为该酶行使功能的必需残基。     

从海蜇中筛选抗真菌活性的海洋细菌菌株

从中国北部湾海域采集的海蜇样品中分离到577株海洋细菌,以条件致病真菌白色念珠菌(Candida albicans)作为敏感测试菌株,采用琼脂块法测定了577株海洋细菌的抗真菌活性,结果表明有119株具有抗白色念珠菌活性,占总数的20.6%。对其中的40株高活性菌株进行抗真菌和抗细菌活性研究,结果表明,有21株海洋细菌对3种或3种以上的真菌有抑制活性,23株对细菌有不同程度的抑制作用,其中1株海洋细菌I0s4-18具有广谱的抗菌作用,对革兰氏阴性细菌、革兰氏阳性细菌、酵母菌及丝状真菌均具有抑制作用。海蜇共附生的微生物中能产生抗真菌活性的微生物的比例是很高的,I0s4-18菌株具有良好的开发前景。     

海洋细菌Bacillus sp.2—羧基还原酶的纯化和性质

从一株海洋细菌Bacillus sp,中通过硫酸铵分级盐析,Q Sepharose FF阴离子交换层析,Hydroxyapatite柱层析和Sephadex G-100凝胶过滤,分离纯化出一种3－脱氧]葡糖醛酮代谢酶,定性为2－羧基醛还原酶,以粗酶液作起始,所获样品纯度提高141．4倍,活力回收率11．4％,2－羧基醛化合物对酶是特异性很好的底物,该酶对3－脱氧葡糖醛酮的Km和2.5mmol/L,分子量约为33kD,反应最适pH为6．2,在pH5．0－8．0,温度30℃以下酶活保持稳定,适量的ED－TA,巯基乙醇或二硫苏糖醇能提高酶的活性,碘乙酸,N-乙基顺丁烯二酰亚胺均造成酶部分失活。     

海洋细菌Bacillus sp.2-羰基还原酶的纯化和性质

从一株海洋细菌Bacillussp .中通过硫酸铵分级盐析、QSepharoseFF阴离子交换层析、Hydroxyapatite柱层析和SephadexG 1 0 0凝胶过滤 ,分离纯化出一种 3 脱氧葡糖醛酮代谢酶 ,定性为 2 羰基醛还原酶。以粗酶液作起始 ,所获样品纯度提高 1 41 4倍 ,活力回收率 1 1 4%。 2 羰基醛化合物对该酶是特异性很好的底物 ,该酶对 3 脱氧葡糖醛酮的Km为 2 5mmol L ,分子量约为 33kD ,反应最适pH为 6 2 ,在pH5 0～ 8 0 ,温度 30℃以下酶活保持稳定。适量的ED TA、巯基乙醇或二硫苏糖醇能提高酶的活性 ,碘乙酸、N 乙基顺丁烯二酰亚胺均造成酶部分失活。