一种新型亮氨酸5-羟化酶NmLEH的异源表达、纯化及酶学性质分析 *

羟基化氨基酸是一种新型氨基酸衍生物,可广泛用作化工材料的前体物及医药合成的中间体。将来源于Nostoc minutum的新型L-亮氨酸5-羟化酶 (NmLEH) 通过重组质粒在大肠杆菌中异源表达。结果表明,在BL21(DE3) 宿主细胞中,诱导温度为25℃,IPTG诱导浓度为0.5mmol/L,诱导10h时,蛋白质表达量最高 (0.45mg/ml);通过Ni-亲和层析和凝胶过滤层析两步分离纯化获得了高度纯化的重组NmLEH蛋白;对NmLEH的酶学性质进行了表征,该酶的最适反应温度为25℃,最适pH 为7.5,在pH 7.0~9.0较为稳定,最适底物为亮氨酸和甲硫氨酸;同源序列分析表明NmLEH属于亚铁和α-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族[Fe(II)/αKG-Dos],并预测了该酶的保守催化活性位点(H150、D152、H236);通过同源建模得到了该蛋白质的模拟结构,分析了该蛋白质催化活性中心的形成机制。     

疏水性氨基酸的羟基化研究进展

羟基化氨基酸在生物技术和分子生物学中具有独特价值,具有抗真菌、抗菌、抗病毒和抗癌的特性。通过比较化学合成与生物催化合成羟基氨基酸的异同,选择具有高对映结构选择性的生物催化合成方法成为羟基氨基酸合成的首选。生物催化实现疏水性氨基酸的羟基化和羟化酶紧密相关,而羟化酶又是单核非血红素Fe(Ⅱ)和α-酮戊二酸依赖型双加氧酶(Fe/αKGDs)的一种,Fe/αKGDs存在共性催化机制。因此,疏水性氨基酸在被催化的过程中,会利用关键中间体高价铁-超氧复合体(Fe(Ⅳ)=O)引起多种氧化转化,从而完成羟基化过程。文中就疏水性氨基酸的羟基化合成及功能应用,尤其是(2S,3R,4S)-4-羟基-异亮氨酸(4-HIL)和羟脯氨酸,进行了详细的阐述,探讨了Fe/αKGDs的共性催化反应机制,并对羟基氨基酸在基础研究和工业中的应用进行了综述。     

来源于糖丝菌双(2-羟乙基)对苯二甲酸酯水解酶的酶学性质表征及降解特性分析

聚对苯二甲酸乙二醇酯[poly(ethylene terephthalate),PET]降解酶的发掘是国内外研究的热点。双(2-羟乙基)对苯二甲酸酯[bis-(2-hydroxyethyl)terephthalic acid,BHET]是PET降解过程的一种中间化合物,会与PET竞争酶的底物结合位点,从而抑制PET进一步降解。因此,探寻新型BHET降解酶,对进一步提高PET的降解效率具有促进作用。本研究通过基因挖掘发现了一种来源于浅黄糖丝菌(Saccharothrix luteola)参与PET降解过程的水解酶基因sle(ID:CP064192.1,5085270–5086049),其编码的蛋白质可以将BHET水解为单(2-羟乙基)对苯二甲酸酯[mono-(2-hydroxyethyl)terephthalate,MHET]和对苯二甲酸(terephthalic acid,TPA)。将BHET水解酶(Sle)通过重组质粒在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达,结果表明,在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导终浓度为0.4 mmol/L,诱导时长为12 h,诱导温度为20℃时蛋白的表达量最高。通过镍亲和层析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析3步分离纯化,获得了高纯度的Sle重组蛋白;同时对其酶学性质进行了表征,Sle最适温度和pH分别为35℃和8.0,在25–35℃和pH 7.0–9.0区间内能保持80%以上的残余酶活,且金属离子Co^(2+)能提高酶活力;进一步通过同源序列及Sle复合物结构分析得知,该酶属于二烯酸内酯水解酶(dienelactone hydrolase,DLH)家族,具备该家族典型的催化三联体,预测其催化位点分别为S129、D175和H207,并初步分析了其催化机理。最后,利用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography,HPLC)鉴定了该酶能够特异性降解BHET生成MHET和TPA,属于BHET降解酶。本研究为生物酶法高效降解PET塑料提供了新的酶资源。