重组阿拉伯糖苷酶在毕赤酵母中的分泌表达及其活性分析

假密环菌是一种果树腐病菌,具有较强的分解代谢纤维素的能力。本文根据已克隆出的阿拉伯糖苷酶基因序列（Accession Number AJ620046）设计引物从假密环菌的mRNA中克隆出阿拉伯糖苷酶的ORF片段,构建重组质粒pPIC9-AF,与组氨酸标签融合,电转化毕赤酵母菌GS115并进行诱导表达。所得到的重组阿拉伯糖苷酶在30-35℃时有较高的酶活,最适反应活性pH值在6.0-8.0之间,而在pH4.0－8.0范围内酶活基本保持在80%以上,比大多已报道的阿拉伯糖苷酶最适pH范围宽。本研究工作对于高效表达重组阿拉伯糖苷酶以及对其进一步的酶学性质研究提供了一个良好的基础。     

三种不同来源的α-葡糖苷酶合成L-抗坏血酸2-葡糖苷的比较

L-抗坏血酸2-葡糖苷(L-ascorbic acid 2-glucoside, AA-2G)是L-抗坏血酸(L-ascorbic acid,L-AA)的衍生物,相比L-AA,其稳定性极好,并且容易被人体利用。α-葡糖苷酶(alpha glucosidase,AG)是最早发现可以产生AA-2G的酶,但合成效率很低。本研究的目的是通过系统评价来源于黑曲霉、粳稻以及大鼠的AG合成AA-2G的活性,为进一步分子改良提高AG合成AA-2G功能筛选候选AG出发酶。人工合成黑曲霉、粳稻以及大鼠来源的AG基因,构建重组工程菌,表达和纯化3种重组酶(AAG, JrAG, RAG),并对它们产生AA-2G的条件进行优化,在最适反应条件下,比较这3种酶的活力、合成AA-2G的产量和转糖率等。研究结果显示,JrAG的比活力为1.9 U/mg、生成AA-2G的量为2 577.2 mg/L、转糖苷率为7.6%;AAG的比活力为1.0 U/mg、生成AA-2G的量为153.10 mg/L、转糖苷率为0.5%;RAG的比活力为0.4 U/mg、生成AA-2G的量为861.0 mg/L、转糖苷率为2.5%;在这3种来...     

假密环菌Armillariella tabescens EJLY2098 β-甘露聚糖酶的克隆、表达及性质分析

本研究利用RT-PCR和RACE技术从Armillariella tabescens EJLY2098(一种食用真菌)中克隆出了β-甘露聚糖酶的全长cDNA,构建到pPICZaA载体上,并在毕赤酵母GSIl5中表达了含His标签的β-甘露聚糖酶(re-atMAN47).该酶的全长cDNA共1481 bp,编码445个氨基酸,序列分析表明该序列除含有β-甘露聚糖酶结构域外,还含有CBD和GHF5的结构域,因此可被归为糖苷水解酶家族5的一个新成员.诱导培养72 h时重组酶活可达到1.067 U/mL,蛋白含量为440 mg/L.重组酶的最适反应温度为60℃.在30℃～65℃比较稳定;酶促最适pH为5.5、4.5～7.0之间比较稳定.这是首次关于Armillariella.tabescens EJLY2098产β-甘露聚糖酶的报道,得到了一个有较好热稳定性、pH稳定性和生物安全性的糖苷水解酶,将在饲料,食品、药物生产等方面有广泛的应用.     

黄曲霉毒素氧化酶/壳聚糖-单壁碳纳米管/聚邻苯二胺修饰电极对杂色曲霉素的检测

将黄曲霉毒素氧化酶(AFO)固定在壳聚糖(CS)-单壁碳纳米管(SWCNTs)杂交膜中,组装在聚邻苯二胺(POPD)修饰的金电极(Au)表面,制备了对杂色曲霉素(ST)敏感的生物传感器(AFO/CS-SWCNTs/POPD/Au)。运用原子力显微镜(AFM)、傅立叶变换红外光谱(FT-IR)和交流阻抗技术(EIS)对电极组装过程进行了表征。循环伏安法研究表明,AFO在修饰电极上发生了准可逆的氧化还原反应,是表面控制过程,其式量电位为-0.436V(vs.Ag/AgCl),说明包埋在CS-SWCNTs中的AFO和电极之间发生了直接电子传递。AFO修饰电极对ST具有明显的电催化作用,其表观米氏常数appKM为7.13μmol/L,催化电流与ST浓度在10～310ng/mL范围内呈线性关系,相关系数为0.997,检出限为3ng/mL(S/N=3),响应时间小于10s。组装的生物传感器具有较好的稳定性与重现性,连续检测20ng/mL的ST标准溶液11次,电流值RSD为3.9%;放置一个月后,其电流响应值仍为初始值的85.6%。该方法具有较高的选择性和灵敏度,应用于实际样品检测时,其回收率在87.6%～105.5%之间...     

妊高征易感基因的研究进展

妊高征具有明显的遗传倾向,其发病机理尚不清楚。本文综述了妊高征易感基因的研究进展,讨论了与高血压、内皮细胞损害、免疫反应失调相关基因和妊高征的关联,并论述了这些基因突变或多态性对妊高征的影响。 Abstract:The etiology and pathogenesis of pregnancy induced hypertension (PIH) remain still unknown.In recent years an increasing amount of evidence supports the concept that PIH is a complex genetic susceptibility disease.The progress in susceptibility gene for PIH is reviewed.The associations between the genes for hypertension,endothelial?cell dysfunction.,immune maladaptation?interaction and PIH have been recently investigated.Meanwhile,the paper evaluates the influences of mutations and polymorphism at the genes on PIH.     

耐高温耐酸稳定假密环菌(Armillariella tabescens) MAN47β-甘露聚糖酶体外分子定向进化

从已经建立的易错PCR初级突变文库中筛选得到的16个兼具耐酸、高温稳定、高酶活力的克隆出发,将其作为DNA shuffling的亲本基因,利用DNA shuffling技术,结合易化筛选和96微孔板通量筛选的方法获得耐酸、高温稳定的克隆。并且,对筛选出来的耐酸高温稳定的突变子进行测序分析和同源建模,比较分析β-甘露聚糖酶突变基因序列的生物学信息。经过两轮DNAshuffling,最终筛选得到一个耐酸高温稳定突变体1108,其在90℃时酶活力还能维持在70%;在pH 3.0时酶活力维持在70%;在高温80℃和pH 4.0的条件下,酶活力是野生型的10倍;常规条件下(pH 6.0,40℃),酶活力是野生型酶的5倍。序列比对发现耐酸、高温稳定突变体1108有三个碱基发生了改变(T289A、A535T、T1085C),导致相应的氨基酸发生了改变(Ser97Thr、Val362Ala、Ile179Leu)。根据同源建模结果和氨基酸性质研究发现,突变位点位于催化中心附近,推测第97位的突变与酶的耐酸性和活性有关,第179位和第362位的突变与酶的高温稳定性有关。实验结果为进一步了解β-甘露聚糖酶MAN47的结构与功能之间的关系提供有用参考。     

具蛋白酶抗性的Armillariella tabescens β-甘露聚糖酶MAN47的分子定向改造

利用定点突变的方法提高Armillariella tabescens β-甘露聚糖酶MAN47的胰蛋白酶抗性。首先根据其氨基酸序列,找到胰蛋白酶的水解位点—赖氨酸(Lys, K)和精氨酸(Arg, R),再利用生物信息学软件获得酶分子结构中K和R与周围溶剂的接触程度,选定暴露程度最大的K280为候选突变位点,进行模拟突变,并分析突变前后的氢键键长和整体结构的变化。根据氢键键长的变化,确定突变体为K280N。对K280N设计突变引物,用重叠延伸PCR技术对MAN47野生型man基因进行突变,PCR产物与大肠杆菌-酿酒酵母穿梭表达载体PYCα连接,在大肠杆菌DH5α中扩增后转入酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae,经人工肠液(pH 6.8 10mg/ml胰蛋白酶溶液)筛选,得到抗胰蛋白酶的最佳突变株。结果表明突变酶在用人工肠液处理180min后,其半衰期为173min,而野生型酶为99min,其他酶学性质与野生型酶基本一致。     

假蜜环菌液体深层发酵条件的研究

对该真菌菌丝体的液体深层培养条件进行了探讨为进一步工业化发酵提供参考数据。方法：在基本培养基的基础上分别改变碳源、氮源、无机元素和C／N比对该菌的液体深层发酵情况,包括测量各培养条件下耗糖情况、绘制生长曲线,观察菌体的生长形态等等。结果：假蜜环菌的菌丝产量在第6d可达到最大值,其后会逐渐降低,并伴有溶菌的现象发生。在培养初期加入微量钴元素有利于刺激糖代谢提高菌体对糖的利用率,其作用主要是缩短延滞期。进入指数生长期后连续补加碳源有利于菌体迅速生长。优化后培养基组成为：葡萄糖l％和蔗糖1％为碳源,以酵母浸膏l％为氮源,KH2PO4 0．1％,MgSO4 0．05％Z,元素钴适量。液体深层发酵培养6d后菌丝生长状态已达到最佳,在此条件下搅拌发酵培养可收获20mg/ml(干重)的菌丝体。