检测牛冠状病毒抗体间接ELISA方法的建立与应用

[背景]牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是引起新生犊牛死亡的主要病原之一,有效的检测手段是防治该病的前提。目前BCoV ELISA检测方法存在敏感性低、不稳定等缺陷。[目的]对原有BCoV ELISA方法进行改进,建立间接ELISA检测方法。[方法]应用我国BCoV流行毒株CD株n基因为模板,预测N蛋白抗原表位,通过原核表达制备可溶性的重组N蛋白作为抗原,建立间接ELISA方法,应用该方法对黑龙江省2010-2017年的BCoV感染进行血清流行病学调查。[结果]该ELISA方法最佳工作条件为:用50 mmol/LpH 9.6碳酸盐作为包被液,抗原包被浓度2.5μg/mL;用PBST作为样本稀释液,稀释浓度1:50,37℃孵育1.5 h;HRP-羊抗牛IgG稀释浓度1:7 500,37℃孵育1.0 h;用1%明胶37℃封闭30 min。阴阳性临界值为0.225。该方法与BRV、BRSV、BVDV、IBRV、BPIV3和E.coli阳性血清均无交叉反应。批内和批间变异系数均小于10%,与病毒中和试验的符合率高达93.5%。对黑龙江省部分地区共603份奶牛血清样品检测结果显示,BCoV抗体阳性率为98.84%。[结论]建立的ELISA方法特异性强、敏感性高、稳定性好,为进一步研发ELISA试剂盒提供了技术基础。     

吸烟和慢性阻塞性肺疾病患者肺血管重建及蛋白激酶C-α表达的研究

目的探讨吸烟和慢性阻塞性肺病(COPD)患者肺血管重建及蛋白激酶C-α(PKC-α)mRNA和蛋白质的表达情况.方法非吸烟非COPD(Controls组)、吸烟非COPD(Smokers组)和吸烟COPD(COPD组)男性肺癌患者各11人,年龄相匹配,取其行肺叶切除术后的外周肺组织.采用免疫组织化学方法检测肺动脉平滑肌细胞增殖细胞核抗原(PCNA)及肺小动脉α-SM-actin染色以显示肺血管重建,逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)对肺小动脉PKC-αmRNA表达进行半定量,免疫荧光及Western blot法检测肺小动脉PKC-α蛋白质表达.结果吸烟非COPD和吸烟COPD患者肺血管重构明显,两组患者肺动脉平滑肌细胞的增殖指数和α-SM-actin表达量均明显高于非吸烟非COPD(P<0.001).吸烟COPD患者肺血管重构更明显,肺动脉平滑肌细胞的增殖指数和α-SM-actin表达量均高于吸烟非COPD(P<0.001,P<0.05).吸烟非COPD患者肺小动脉PKC-α在转录和翻译两个水平的表达均明显高于非吸烟非COPD患者(P<0.001);吸烟COPD患者动脉血氧分压PaO2明显低于吸烟非COPD患者(P<0.05),肺小动脉PKC-αmRNA及蛋白质表达水平均明显高于吸烟非COPD患者(P<0.01).结论长期吸烟导致肺血管重建,既有香烟的直接作用,又有长期吸烟诱导COPD的低氧因素,其机制可能是通过细胞内PKC生物信号传导通道.     

牛副流感病毒3型HN基因原核表达及间接ELISA方法建立

用构建的HJ-1株牛副流感病毒3型HN基因原核表达载体pQE30-HN,在E.coli XL1Blue中表达了重组HN蛋白,并用电洗脱方法从电泳凝胶中纯化了该重组蛋白作为包被抗原,建立了检测该病毒抗体的ELISA方法。建立的ELISA最佳工作条件分别是:抗原浓度为6μg/mL,血清稀释度为1∶50,封闭液为5%脱脂奶粉,封闭条件为37℃60min,酶标抗体工作浓度为1∶10 000;阳性临界值为OD450≥0.30。该方法与病毒中和试验符合率高达96%,板内和板间重复性试验变异系数均小于10%,重复性较好。该方法与牛冠状病毒、传染性鼻气管炎病毒和呼吸道合包体病毒阳性血清无交叉反应。应用该方法检测黑龙江省部分地区323份奶牛血清样本,对牛副流感病毒3型抗体血清阳性率为57.89%。该ELISA方法的成功建立为进一步研发ELISA试剂盒提供了技术基础。     

猪一般型生殖道放线菌的分离鉴定与系统进化分析

2007年4月, 从患有化脓性肺炎、化脓性关节炎和心内膜炎的8周龄病死仔猪内脏器官中分离到一株细菌, 对其进行了种属关系鉴定、致病性及药物敏感性等研究。首先从表型特征和生化特性方面进行鉴定, 然后应用分子技术对其16S rDNA进行测序分析, 最后进行了动物实验和药物敏感性实验。该细菌表型特征和生化特性表明其与生殖道放线杆菌(A. hyovaginalis)非常相似; 对16S rDNA测序结果分析发现其与A. hyovaginalis III群菌株同源性高达99.2%, 系统进化分析也表明分离株与A. hyovaginalis III群菌株亲缘关系最近; 对小白鼠具有较强的致病性; 对红 霉素、庆大霉素和阿米卡星等药物高度敏感。因此, 证实分离菌株为有致病性的A. hyovaginalis III型。     

常规腹腔镜器械下经脐单孔腹腔镜胆囊切除术

目的:前瞻性分析常规腹腔镜器械下的经脐单孔腹腔镜胆囊切除术.方法:2009年3月至2009年7月,入选18例胆囊疾病患者行经脐单孔腹腔镜胆囊切除术.该手术使用常规腹腔镜器械及经脐部同一小切口的三个穿刺套管.结果:18例患者(男性5人,女性13人)均没有中转为常规多孔腹腔镜或开放手术.患者平均年龄39岁(25-53岁),平均手术时间69 min(45-115 min).无明显失血或并发症发生.患者平均术后住院天数为1.7天(1-3天).术后患者满意度为100％.术后2周,患者脐部切口几乎不可见.结论:常规腹腔镜器械下经脐单孔腹腔镜胆囊切除术是可行的.它能够在没有专门器械及额外费用的情况下实施.     

牛副流感病毒3型的分离鉴定

从黑龙江省某牛场患有呼吸道疾病的病牛鼻液中分离到1株病毒, 该病毒能在MDBK细胞上增殖并产生特征性细胞病变, 对分离毒株进行理化特性、RT-PCR鉴定及序列测定与分析, 结果发现该病毒为RNA病毒, 具有血凝性, 对乙醚、氯仿极其敏感, 不耐热, 对酸的抵抗力差; 分离株与GenBank中已发表的病毒株N基因片段的同源性为82.6%~99.1%, 结果表明分离的病毒为牛副流感病毒3型毒株, 命名为BPIV3 DQ1株。根据GenBank上发表的牛副流感病毒3型核衣壳蛋白N基因序列, 设计合成了一对特异性引物, 能扩增704 bp的目的片段, 可以检测出10个 TCID50/100 μL病毒核酸。     

牛化脓性隐秘杆菌病PCR诊断方法的建立

近几年犊牛化脓性肺炎发病率逐年升高, 经检测该病原以化脓性隐秘杆菌为主, 研究建立快速检测化脓性隐秘杆菌的PCR诊断方法。根据化脓性隐秘杆菌16S rRNA基因设计并合成一对特异性引物, 对PCR条件进行优化后通过特异性试验和敏感性试验检测其特异性和敏感性。扩增出927 bp目的基因, 最佳引物浓度为0.2 μmol/L、退火温度58°C、Mg2+浓度1.5 mmol/L, 特异性试验结果表明化脓性隐秘杆菌参考菌株能扩增出927 bp目的基因, 而大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、化脓链球菌、蜡样芽孢杆菌、沙门氏菌、肺炎克雷伯氏菌和变形杆菌等的扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明, PCR的最低检出量为42个化脓性隐秘杆菌。建立的牛化脓性隐秘杆菌的PCR诊断方法, 具有较高的特异性和敏感性, 为化脓性隐秘杆菌引起的牛化脓性肺炎的快速诊断及流行病学调查提供了新的手段。     

基于猪细小病毒病毒样颗粒的结肠癌靶向纳米载体的构建

【目的】获得具有结肠靶向的纳米载体。【方法】采用SOE-PCR方法将具有结肠靶向的TK肽序列插入到猪细小病毒(PPV)结构蛋白VP2的环2和环4区域得到TK-vp2(?vp2)基因,在Bac-to-Bac?杆状病毒表达系统中构建、表达和自组装。【结果】通过SOE-PCR方法扩增获得?vp2基因,在Bac-to-Bac?杆状病毒表达系统中构建得到Bacmid-?vp2,经脂质体转染至Sf9昆虫细胞得到重组杆状病毒。直接免疫荧光试验、SDS-PAGE和Western blot检测结果表明?VP2蛋白在Bac-to-Bac?杆状病毒表达系统中获得融合表达,目的蛋白约70 k D;透射电子显微镜结果显示?VP2能自组装形成病毒样颗粒(TK-VLPs),直径范围在22 nm-30 nm。【结论】获得纳米载体TK-VLPs,为进一步研究其作为结肠靶向的纳米载体奠定物质基础。