红笛鲷仔鱼体内特异性母源抗体降解动力学研究

应用山羊IgG免疫红笛鲷亲鱼,人工催产孵化出仔鱼后,用双抗体夹心法检测仔鱼特异性抗体的降解过程,发现抗体水平随时间变化呈下降趋势且可以持续7d,每尾仔鱼特异性抗体降解量约0.001μg,最低检测限为0.482μg/mL。采用饱和硫酸铵分步盐析与亲和层析等方法纯化红笛鲷仔鱼特异性抗体,结果显示,盐析仔鱼特异性抗体最理想的硫酸铵饱和度为40%－50%;亲和层析分离到两个明显独立的层析峰。SDS-PAGE证明纯化的抗体具有极高纯度,其L、H链分子量分别为29 kD和77.5 kD,抗体分子量约为852 kD。该抗体不仅能够与山羊IgG产生特异性免疫反应,而且能与兔抗红笛鲷IgM抗血清产生免疫反应,因而认为红笛鲷母源抗体可以垂直转移至仔鱼。     

鱼源溶藻弧菌胞外产物的特性研究

溶藻弧菌经胰胨大豆胨琼脂培养基(TSA 2%NaCl)培养48h后,培养物用PBS洗脱、离心,再经孔径0.22μm微孔滤膜过滤,制得胞外产物(Extracellular product,ECP)。经检测,该ECP具有淀粉酶、酪蛋白酶、卵磷脂酶和脂肪酶等4种酶活性,其中淀粉酶的活性最高,酪蛋白酶、脂肪酶活性次之,卵磷脂酶活性较低,未检测出明胶酶及脲酶活性;能溶解断斑石鲈(Pomadasys hasta)、眼斑拟石首鱼(Sciaenops ocellatus)和赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)的红细胞,而不能溶解鸡、羊及O型人红细胞;对小白鼠和石斑鱼的LD50分别为0.08mg/g和0.17mg/g,95%可信限分别为0.06—0.12mg/g和0.07—0.28mg/g;50mmol/L EDTA和100mmol/L苯甲基磺酰氟能使胞外蛋白酶(Extracellular pro-teinase,ECPase)的活性分别下降83.40%和51.32%;ECPase对热稳定性较差,碱性条件下活性较高,其最适温度为50℃,最适pH为8.0。     

弓形革囊星虫组织结构和超微结构观察

弓形革囊星虫(Phascolosoma arcuatum)是近年兴起的水产养殖品种,目前已形成一定养殖规模,但是其生物学特性相关的研究只有零星报道。本文主要采用石蜡切片苏木精-伊红(H.E)染色和扫描电镜方法对弓形革囊星虫的整体形态和各主要器官的结构进行研究。结果表明,弓形革囊星虫主要由吻部和躯干部构成,躯干部有乳突分布;吻部由触手和项器构成,伸长可达躯干部的两倍,具有感光性。其消化系统由口、食道、肠、肛门四个部分构成,不同部分的肌肉组织存在明显差异;收吻肌一端与吻相连,另一端分成4支,分别连于背部两侧(背收吻肌)和腹部两侧(腹收吻肌);食道贴于收吻肌,后连接肠。肠分为肠下回环与肠上回环,肠上回环与肠下回环缠绕盘旋,肠上回环后接直肠。直肠具有盲囊,后连接肛门;两条肾管分布在腹侧。     

无乳链球菌诱导吉富罗非鱼分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的克隆及原核表达

以灭活的无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)诱导后的吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)为材料,构建其头肾SMART cDNA文库,应用同源性克隆和RACE-PCR技术克隆到吉富罗非鱼(O.niloticus)分泌型免疫球蛋白M(sIgM)重链基因的全长cDNA序列并对其进行生物信息学分析。sIgM基因cDNA全长为1 921 bp,开放阅读框(ORF)为1 740 bp,5'端非编码区(5'-UTR)41 bp,3'端非编码区(3'-UTR)140 bp,编码579个氨基酸,N端有信号肽结构。预测分子量(MW)为64.26 kD,理论等电点(pI)为5.36。系统进化树分析显示,吉富罗非鱼(O.niloticus)sIgM与牙鲆(Paralichthys olivaceus)和军曹鱼(Rachycentron canadum)的亲缘关系较近。sIgM基因有4个恒定区。将吉富罗非鱼(O.niloticus)sIgM基因恒定区序列克隆到原核表达载体pET-28a(+)中,构建原核表达质粒pET28-sIgM,诱导表达后确定最优条件为37℃条件下,IPTG浓度为0.05 mmol/L时诱导4 h蛋白表达量最大。纯化蛋白后经Western blot分析,sIgM融合蛋白与鼠抗His-Tag发生特异结合,表明目的蛋白成功表达。     

海水亚硝酸氧化细菌初始富集过程中硝酸盐的定性检测

本文对海水亚硝酸氧化细菌初始富集过程中硝酸盐的定性检测方法及其适用范围进行了研究。结果表明, 在NaNO2起始浓度为100mg/L的亚硝酸氧化细菌初始富集培养系统中,1mL培养液中残余的NaNO2,可先用 1．0mol/L盐酸溶液20μL和50g/L氨基磺酸铵溶液10-20μL将其去除,然后再用二苯胺试剂对培养液中经亚硝酸 氯化细菌转化来的NaNO3进行定性检测,可检测出的NaNO3浓度下限在20mg/L左右。在NaNO2起始浓度不同的 富集培养系统中,去除NaNO2所需盐酸溶液、氨基磺酸铵溶液的量可根据其起始浓度按比例相应增减,但NaNO2的 起始浓度不宜超过200mg/L。该方法亦适用于淡水亚硝酸氧化细菌初始富集培养过程中硝酸盐的定性检测。     

红罗非鱼Na~+-K~+-ATPase α基因的克隆及其在不同盐度条件下mRNA表达差异

为获知红罗非鱼(Oreochromis sp.)Na+-K+-ATPaseα基因的全长分子结构及其在不同盐度条件下的表达情况,采用同源克隆及cDNA末端快速扩增(RACE-PCR)方法,首次在红罗非鱼鳃组织中克隆到了全长为3 379 bp的Na+-K+-ATPaseα基因全长cDNA序列,该序列包含3 072 bp的开放阅读框(ORF),143 bp的5'末端非编码区(UTR)和164 bp的3'末端非编码区(UTR),编码1023个氨基酸,预测分子量为112.5 kD,理论等电点为5.26。BLAST分析显示红罗非鱼Na+-K+-ATPaseα基因编码的氨基酸序列与其它已知物种相应基因编码的氨基酸序列的同源性达到97%-99%;系统进化分析显示,红罗非鱼Na+-K+-ATPaseα亚基与萨罗罗非鱼(Sarotherodon melanotheron)和莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)亲缘关系较近。应用Real-time PCR技术,以β-actin基因为内参,对不同盐度(0、15、25、32 g/L)条件下鳃组织中Na+-K+-ATPaseα基因的表达情况进行了比较分析,结果表明,当盐度为25 g/L时,Na+-K+-ATPaseα基因的表达量达到峰值,而盐度升至32 g/L时,其表达量呈下降趋势;各盐度处理组中,养殖12 h后Na+-K+-ATPaseα基因的mRNA表达量显著上升(P0.05)并达到最高;随着养殖时间的延长,24 h后该基因mRNA表达量开始降低,但仍然显著高于对照组的表达量值(P0.05)。     

溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统分子伴侣护航蛋白VscO的基因克隆及其生物信息学分析

克隆了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ03株Ⅲ型分泌系统(T3SS)分子伴侣护航蛋白(Chaperone escort protein)vscO基因,并对其进行生物信息学分析。结果表明,vscO基因全长462 bp,编码153个氨基酸,理论分子量约为18.43 kD,pI值为9.22。细胞定位分析显示vscO基因位于外周质,不存在信号肽,无跨膜区。vscO基因具有转录起始区-35区和-10区,以及翻译识别信号SD序列(Shine-Dalgarno sequence)。该氨基酸序列含有多种活性位点,如蛋白激酶C磷酸化位点等。系统进化树发现溶藻弧菌的VscO蛋白与副溶血弧菌聚为同一亚族。VscO亚基三维结构模型显示其与副溶血弧菌T3SS的YscO蛋白有相似构型。信号通路分析推测VscO位于T3SS的针状样结构上。蛋白网络互作图谱发现VscO与10种T3SS蛋白具有相邻关系。本研究结果将为溶藻弧菌Ⅲ型分泌系统护航机制的研究奠定基础。     

溶藻弧菌脂多糖对石斑鱼免疫功能的影响

脂多糖 (Lipopolysaccharide ,LPS)是G 菌细胞壁中的主要成分之一 ,是细菌内毒素的主要物质 ,不仅可引起机体良好的体液免疫应答 ,而且也可提高机体的非特异性免疫功能。Bog wald[1]发现LPS能导致实验鱼产生特异性抗体 ,而且还增强鱼体的免疫吞噬能力 ;MacArthur等[2 ]报道LPS可提高鲽 (pleu ronectesplatessa)体内巨噬细胞的游走能力 ;Solem[3 ]认为LPS可促进大西洋鲑 (Atlanticsalmon)巨噬细胞的分裂且提高其吞噬活性和鱼体抗感染的能力。本文用溶藻弧菌LPS免疫石斑鱼后 ,分析了石斑鱼血清抗体效价的变化、LPS对石斑鱼血清溶菌…     

溶藻弧菌kdpD基因敲除突变株的构建及其表型特征

【目的】探究kdpD基因对溶藻弧菌生物学特性的影响。【方法】采用Overlap PCR和同源重组技术,结合正负向筛选,构建kdpD基因无标记基因框内敲除突变株,比较kdpD突变株和野生株HY9901在生长速率、胞外蛋白酶活性以及毒力等方面的差异。【结果】成功构建溶藻弧菌kdpD基因敲除突变株。体外实验表明,kdpD的缺失对溶藻弧菌的生长曲线和胞外蛋白酶活性的影响不明显,但是突变株的泳动能力和生物被膜形成能力出现下降。斑马鱼致病性试验结果显示,突变株毒力下降了8.84倍。【结论】kdpD基因参与调控溶藻弧菌的泳动能力、被膜形成和毒力,但不影响生长速率和胞外蛋白酶活性。     

饵料系列对军曹鱼仔鱼生长、消化酶活力和体成分的影响

饵料是鱼类早期发育最重要的条件之一,并且随着个体发育,饵料类别不断变化。为了评定各种饵料的效果并筛选得到军曹鱼仔鱼早期发育阶段适宜的饵料组合,进行了本实验。军曹鱼仔鱼在750L桶中孵出并暂养2d,然后在水泥池中培育4d（3—6日龄）,并投喂轮虫;在第7日龄,将240尾仔鱼随机平均分配至12个70L桶中,共分4组,每组3桶;7—15日龄,4组仔鱼分别投喂轮虫、卤虫无节幼体、桡足类和桡足类投;16—42日龄,分别投喂轮虫、卤虫无节幼体、桡足类和鱼糜。第42日龄,将全部仔鱼取样、称重并于-80℃保存备用。鱼体匀浆、离心后的上清液作为粗酶液用以测定蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等消化酶活力,还测定了粗蛋白、粗脂肪等主要体成分,并统计了生长指标。结果表明：（1）组IV的生长表现最佳;（2）组III的成活率最高;（3）饵料对三种酶的活力和体成分都有极显著的影响;（4）组III的蛋白酶活力、组I的淀粉酶活力和脂肪酶活力最高,尤其是组I的淀粉酶活力比其他各组高出6.8—11.9倍;（5）各组鱼体的粗蛋白含量均较相应饵料的低,而粗脂肪含量则比饵料的高。因此,可以认为：仔鱼长期饥饿时,消化酶可能存在补偿性分泌,并优先利用糖类和脂肪作为能源;军曹鱼仔鱼对脂肪的沉积效率较蛋白高。