应用动态光散射对一些蛋白质结晶性能的研究

动态光散射是研究生物大分子溶液物化行为和结晶性能的重要工具。以溶菌酶为模型蛋白 ,对其溶液的DLS研究表明 ,一定范围的蛋白质浓度不会影响蛋白质聚合性质 ,而起沉淀剂作用的盐对多色散性的影响较大。考虑这些研究结果 ,应用DLS研究对空间微重力下晶体生长样品的质量做了考察 ,这对于提高空间样品准备水平 ,进而提高空间实验成功率是一重要途径。     

两种不同植物来源白藜芦醇生物合成关键酶——芪合酶催化效率比较

白藜芦醇是一种天然植保素,且具有特殊的药理和保健功能,芪合酶(Stilbene synthase,STS)是该化合物生物合成的关键酶和限速酶。白藜芦醇存在于有限几种植物且含量差异很大,虎杖中白藜芦醇含量比葡萄、花生高1 000倍以上,推测不同STS的催化能力有可能是白藜芦醇含量差异的原因之一。为验证上述推测,文中通过overlap PCR技术从葡萄叶片基因组DNA中克隆得到葡萄STS基因,连同前期工作中获得的虎杖STS基因(PcPKS5),进行了原核表达分析。诱导表达产物经过Ni2+亲和柱纯化和PD-10柱脱盐后,均得到分子量约43 kDa的可溶性纯化蛋白。酶促产物分析结果表明,两种酶催化产物均为白藜芦醇。酶动力学分析表明,虎杖STS催化效率(Kcat/Km)是葡萄STS的2.4倍。文中从植物类型Ⅲ聚酮化合物合酶(Polyketide synthase,PKS)超家族催化活性位点和保守位点角度分析了造成上述两种酶活性产生差异可能存在的原因。     

植物类型III聚酮合酶超家族晶体结构与功能

植物类型Ⅲ聚酮化合物合酶(PKS)催化合成多种植物次生代谢产物的基本分子骨架,参与植物体许多重要生物学功能的行使,一直是研究蛋白结构与功能关系、基于结构进行分子改造的重要模式分子家族。目前在蛋白质数据库(PDB)中有超过80个不同种属来源的类型Ⅲ PKS的三维结构被报道,其中包括了研究最为透彻的查尔酮合酶在内的7种酶的晶体结构,这些结构的发表对于阐明该类酶复杂多变的底物专一性、链延伸和不同的环化反应机制奠定了结构基础。三维空间结构解析以及基于定点突变的结构功能分析是进行酶工程、基因工程的基础。以下系统综述了植物类型Ⅲ PKS超家族晶体结构和功能的研究进展。     

定点突变提高虎杖聚酮合酶的苯亚甲基丙酮合酶活性北大核心CSCD

虎杖(Polygonum cuspidatum)聚酮合酶(polyketide synthase 1,PcPKS1)同时具有查尔酮合酶(chalcone synthase,CHS)及苯亚甲基丙酮合酶(benzylidene acetone synthase,BAS)催化活性,能够催化生成聚酮类化合物柚皮素查尔酮和苯亚甲基丙酮,进而催化合成黄酮类或覆盆子酮等具有多种生物学活性的化合物。本研究通过分析虎杖PcPKS1与掌叶大黄(Rheum palmatum)BAS、拟南芥(Arabidopsis thaliana)CHS等家族成员的序列以及酶催化位点的构象,确定可能影响酶功能的3个氨基酸位点:Thr133、Ser134、Ser339。采用定点突变对PcPKS1进行分子修饰,成功获得2个突变体并进行相关体外酶促反应,高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)产物分析结果表明,在pH 7.0和pH 9.0的体外酶促条件下,突变体T133LS134A和S339V维持BAS和CHS双功能活性,且BAS活性显著高于原PcPKS1。本研究为利用PcPKS1进行基因工程调节黄酮类和覆盆子酮化合物的生物合成提供理论依据。     

生氰糖苷类物质的结构和代谢途径研究进展

生氰糖苷类成分作为多种植物的防御物质被广泛研究。随着对其研究的深入,发现在细菌、真菌、节肢动物和鳞翅目昆虫体内也存在该类物质,生氰糖苷具有防御和性信息素等作用。本文对该类物质的结构、合成和降解途径等方面进行了综述,为新农药先导化合物的发现提供理论依据。     

虎杖苯亚甲基丙酮合酶PcPKS2的表达纯化和晶体生长

植物类型Ⅲ聚酮合酶超家族(PKSs),又称查尔酮合酶(Chalcone synthase,CHS)超家族,催化合成多种植物次生代谢产物的分子骨架。苯亚甲基丙酮合酶(Benzalacetone synthase,BAS)催化4-香豆酰辅酶A与丙二酰辅酶A通过一步脱羧缩合反应生成苯亚甲基丙酮,是一系列具有重要生物学活性苯丁烷类化合物及其衍生物的前体化合物。前期工作从虎杖中分离出苯亚甲基丙酮合酶BAS(PcPKS2)和1个具有CHS和BAS活性的双功能酶(PcPKS1)。两者与超家族其他成员序列经比较,在包括门卫氨基酸Phe215和Phe265在内的重要氨基酸序列存在一定差异。已有蛋白晶体学研究结果表明,PKSs家族不同成员的功能多样性来自于酶催化位点的非常微小的构象变化。为了能够从结构上比较PcPKS2和Pc PKS1双功能酶活性差异可能产生的机制,以确定其高效BAS活性的分子机理,研究利用了大肠杆菌原核表达系统过量表达了C-端融合有His6标签的重组蛋白,经纯化得到了高纯度蛋白。经过对其晶体生长条件进行摸索和优化,得到了能用于X-射线衍射的单晶,为其结构解析、催化机理研究、了解虎杖聚酮类化合物生物合成机制和该类酶在基因工程中的应用提供了基础。     

辣蓼不同种间植物次生代谢产物种类及差异

辣蓼是一种广泛分布于我国的传统中草药,通常指水辣蓼(Polygonum hydropiper)和旱辣蓼(Polygonumflaccidum)的干燥全草,具有健脾化湿、除湿化滞、止痢止痛、解毒化瘀等功效。近几年两种辣蓼植物提取物在兽药、植物源农药方面进行了较为深入研究,结果表明,水辣蓼和旱辣蓼的作用机制、功效及应用方向存在明显差别。本文对上述两种植物的次生代谢产物种类及其差异进行了综述和对比分析,为辣蓼植物活性成分功能研究与深化利用提供依据。     

植物尿苷二磷酸糖基转移酶超家族晶体结构

糖基转移酶(Glycosyltransferases,GTs)催化的糖基化反应几乎是植物中最为重要的反应。GTs家族1中的植物UGTs(UDP-dependent glycosyltransferases)成员主要运用尿苷二磷酸活化的糖作为糖基供体,因其成员众多、生物功能多样,仅仅通过序列比较和进化分析不能够精确预测其复杂的底物专一性和特有的催化机制,需要后续生化实验的进一步验证。文中主要总结了目前在蛋白结构数据库(Protein Data Bank,PDB)中报道的5种植物UGTs的晶体三维结构和定点突变功能研究进展。详细介绍了植物UGTs整体结构的特点以及蛋白与底物相互作用的细节,为更有效地生化定性UGTs以便深入理解底物专一性提供了有力的工具,从而为植物UGTs在酶工程和基因工程中的应用奠定基础。