利用光合细菌进行微生物修复：一种降低辛硫磷在养殖水中积累的低成本方法

[背景] 中国是农业生产大国,渔林农牧占比庞大。有机农药无论在畜牧业还是水产养殖业都有广泛的应用。有机磷农药（Organophosphorus Pesticide,OP）是应用最广泛的有机农药,具有低毒和不易残留的优点。OP在水体中大量积累可通过生物富集作用间接影响人体健康,由此产生的生殖毒性不容忽视。光合细菌作为环境友好型水体有益菌,部分菌种具有降解有机农药的功能。[目的] 自上海海洋大学明湖中分离纯化得到一株光合细菌（编号SPZ）。探究其对辛硫磷的耐受程度及降解效果,为养殖水体中有机磷农药的生物降解提供目的菌株。[方法] 利用16S rRNA基因序列分析方法对目标菌株进行种属鉴定;利用紫外分光光度法测定分离菌株SPZ和标准菌株ST在不同接种量下的OD₆₆₀并测定实验周期内光合细菌在不同浓度辛硫磷中OD₆₆₀的变化趋势,以示辛硫磷对光合细菌的毒性作用;利用高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography,HPLC）测定菌株对水体辛硫磷的降解能力;通过HPLC测定加热致死菌与活菌对水体辛硫磷的降解能力,确定菌株对辛硫磷的降解方式。[结果] 16S rRNA基因序列分析表明菌株SPZ与红假单胞菌属相似度高达99%以上,与沼泽红假单胞菌ATCC 17001菌株聚为一支,置信度为100%;菌株SPZ与菌株ST的适宜接种量为10%;菌株SPZ可耐受100 mg/L的辛硫磷,当浓度超过该值后,辛硫磷对光合细菌生长产生显著的抑制作用;当光合细菌进入生长稳定期后添加辛硫磷,1 d时可相对降解辛硫磷（12.97%-26.69%,20.0 mg/L;24.25%-32.85%,2.0 mg/L;16.66%-34.59%,0.2 mg/L）,3 d时可相对降解辛硫磷（46.63%-53.95%,20.0 mg/L;24.78%-30.34%,2.0 mg/L;31.92%-39.25%,0.2 mg/L）,5 d时可相对降解辛硫磷（93.65%-97.72%,20.0 mg/L;67.69%-74.41%,2.0 mg/L;10.34%-24.27%,0.2 mg/L）。[结论] 菌株SPZ作为一种常见光合细菌,能够有效去除水体中的辛硫磷农药,具有生物修复功能,在水产养殖和有机磷农药污染水处理中有广阔的前景。     

草鱼呼肠孤病毒NS31蛋白在昆虫细胞中表达及互作多肽筛选

草鱼呼肠孤病毒(Grasscarpreovirus,GCRV)是引发病毒性草鱼出血病的主要病原.前期研究证实GCRV-S7基因片段编码NS31蛋白是GCRV的非结构蛋白,在病毒感染的中后期表达.为深入开展NS31的具体生物学功能,本研究从GCRV-JX01株病毒基因组中扩增NS31,克隆至pFastBacHTA载体;利用杆状病毒Bac-to-Bac系统成功表达携带his标签的重组蛋白his-NS31;Western-Blot和IFA实验表明重组杆状病毒能够感染昆虫细胞(Sf9)表达NS31,进一步通过his-Ni2+柱纯化NS31,SDS-PAGE鉴定蛋白约为30KD.运用噬菌体展示技术筛选噬菌体12肽库,研究NS31特异性结合多肽.挑取30个克隆进行DNA序列测定,结果表明NS31主要和2种多肽分子相互作用.进一步结合生物信息学分析表明上述多肽与草鱼基因组中6个基因具有同源性,提示其可能是NS31互作蛋白.本研究为深入探索NS31在病毒感染过程中的生物学功能奠定了重要基础.     

利用噬菌体展示技术筛选草鱼呼肠孤病毒VP39蛋白相互作用多肽

VP39是草鱼呼肠孤Ⅲ型病毒(GCRV GenotypeⅢ, GCRV-Ⅲ)S9基因编码的蛋白,为研究VP39蛋白在GCRV-Ⅲ感染草鱼细胞过程中行使的生物学功能,将克隆VP39基因序列并构建原核表达载体pET32a-VP39,通过原核表达得到VP39-HIS融合蛋白;利用VP39蛋白溶液免疫小鼠,制备鼠抗VP39多克隆抗体,通过Western Blot对抗体进行评估;利用制备的多克隆抗体探究GCRV-Ⅲ感染细胞过程中VP39蛋白表达动力学;利用噬菌体展示技术筛选与VP39蛋白特异性结合的多肽序列并进行分析。SDS-PAGE电泳结果显示, VP39-HIS融合蛋白可良好溶于PBS中,蛋白大小约为39 kD; Western Blot检测表明实验所制备的VP39多克隆抗体在1:10000稀释比例下,既能识别原核表达的VP39-HIS融合蛋白,也能识别GCRV-Ⅲ感染CIK细胞后表达的VP39蛋白,具有良好的效价与特异性;在病毒侵染过程中, VP39前期表达量较少,在中后期大量表达;噬菌体展示技术筛选出两条多肽与VP39蛋白有高度亲和性,经过在NCBI上比对后发现草鱼基因组中有7个基因与筛...     

甜味蛋白研究的新进展

甜味蛋白(thaumatin)是世界上已知最甜的物质,具有很大的应用前景.Thaumatin的基因核苷酸和蛋白质氨基酸序列都已测定.晶体分析表明它具有高稳定的四级结构.在味蕾小孔中发现了介导thaumatin发生作用的物质.Thaumatin自身的功能仍不清楚.在多种生物中发现了thaumatin类似蛋白质,具有不同的生物活性.用基因工程手段实现了thaumatin在多种原核和真核生物中的表达,但迄今仍未得到理想的基因工程产品.     

水产养殖用解淀粉芽孢杆菌微胶囊的安全性评价

目的:评价水产养殖用解淀粉芽孢杆菌微胶囊的安全性。方法:参照《GB/T21805-2008化学品藻类生长抑制试验》、《GB/T13266-91水质物质对蚤类(大型蚤)急性毒性测定方法》、《GB/T13267-91水质物质对淡水鱼(斑马鱼)急性毒性测定方法》、《渔药临床试验技术规范》等国家标准及相关法规,观察了解淀粉芽孢杆菌微胶囊对小球藻生长的抑制作用以及对大型蚤、斑马鱼和草鱼的急性毒性,分析了其对养殖水体主要理化因子的影响。结果:解淀粉芽孢杆菌微胶囊在终浓度为0.2～2 000mg/L时对小球藻生长具有促进作用,对小球藻的半数抑制浓度大于2 000mg/L,而且其对大型蚤、斑马鱼和草鱼的半数致死浓度也大于2 000mg/L(或mg/kg体重)。此外,在养殖水体中加入解淀粉芽孢杆菌微胶囊至终浓度为0.2～2 000mg/L后14天内,各浓度组的氨氮含量、硫化物和pH均缓慢下降,仅亚硝酸盐氮含量稍微升高后逐渐缓慢降低,但这些理化因子的变化与解淀粉芽孢杆菌微胶囊的加入量呈负相关关系。结论:解淀粉芽孢杆菌微胶囊实际无毒,对养殖水中氨氮、亚硝酸盐氮、硫化物和pH等理化因子的影响均控制在虾虎鱼仔鱼、黄颡鱼、白斑狗鱼、克氏原螯虾等水产养殖动物的安全浓度范围内,为其在水产养殖中的安全应用提供了重要的科学依据。     

西伯利亚鲟嗜水气单胞菌与其它3株气单胞菌间的免疫交叉反应

采用间接免疫荧光技术分析了西伯利亚鲟细菌性败血症致病菌嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophlia)X1菌株、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)XL2-T菌株、致病性温和气单胞菌(Aeromonas sobria)W1菌株与无致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophlia)M3菌株等水产养殖主要病原菌与抗血清之间的免疫交叉反应。结果显示具有致病性的同属菌株X1菌株、XL2-T菌株、W1菌株交叉反应程度较大,说明这3株菌表面存在较多相同抗原决定簇。而无致病性菌株M3与其他3株致病性菌株免疫交叉反应程度较小。     

西伯利亚鲟致病性嗜水气单胞菌外膜蛋白及其抗原性分析

采用十二烷基肌氨酸钠(Sarkosyl)法提取西伯利亚鲟嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)外膜蛋白,电泳显示所提取的主要外膜蛋白分子量为26～120 kDa;为比较该菌株与气单胞菌菌属其他细菌外膜蛋白组分及抗原性异同,以致病性豚鼠气单胞菌(A.caviae)、温和气单胞菌(A.sobria)和无致病力的嗜水气单胞菌为对照,电泳图谱显示4种气单胞菌外膜蛋白的分子量主要集中在26～120 kDa之间;利用抗西伯利亚鲟嗜水气单胞菌血清的免疫印迹试验表明该菌株外膜蛋白中分子量为75 kDa、52 kDa、43 kDa、40 kDa、34 kDa、28 kDa的蛋白条带呈现阳性反应,其他3种气单胞菌外膜蛋白中均有与该抗血清反应的条带,且分子量为28 kDa、34 kDa的反应条带为4株菌共有;43 kDa与75 kDa反应条带为部分菌株共有.为进一步筛选和研究致病性气单胞菌的共同保护抗原提供参考.     

鲤疱疹病毒Ⅱ型抗体胶体金检测试纸条的制备和分析

【背景】由鲤疱疹病毒Ⅱ型(cyprinid herpesvirus-2, CyHV-2)引起的疱疹病毒性造血坏死病在鲫和金鱼中的暴发给水产养殖业造成了巨大的经济损失。【目的】开发一种快速、现场检测鲫是否感染过CyHV-2和监测鲫CyHV-2IgM抗体水平的胶体金检测试纸条。【方法】将CyHV-2与胶体金结合作为金标抗原、Protein A作为检测线、兔源rORF66多克隆抗体进行划线作为质控线，分析胶体金试纸条最佳制备及组装条件，确定胶体金标记最适pH、金标抗原最适浓度，以及检测线(test line, T线)、质控线(control line, C线)最适划线浓度等。【结果】本研究制备的CyHV-2抗体胶体金试纸条可以使用全血测试，与常见的其他鱼类抗体血清无交叉反应，如草鱼呼肠孤病毒抗体阳性血清、鳜虹彩病毒抗体阳性血清等。试纸条最低限度可以检测到1:100稀释的阳性血清抗体，由试纸条检测线的深浅可以初步判断鱼体中抗体水平。试纸条通过对10条鲫鱼血清样品检测并和金鱼造血器官坏死病毒检测方法(GB/T 36194—2018)进行Kappa分析，Kappa值为0.80，表明二者有较高的符合...     

草鱼Fibulin-4蛋白与草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白相互作用的研究

草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)是当前引起我国草鱼出血病的主要病原,其外衣壳蛋白通常在病毒的组织嗜性和细胞嗜性上发挥重要作用。本研究利用共定位、Dot-Blot技术和His-Pull Down技术,验证了草鱼Fibulin-4蛋白与草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白的相互作用。将pDsRed1N1-VP7,pDsRed1N1-VP56分别与pEGFP-Fibulin-4共转染草鱼性腺细胞GCO。结果显示,病毒蛋白VP7,VP56和草鱼蛋白Fibulin-4均分布于细胞质中,两种蛋白都与Fibulin-4有部分重叠。应用Dot-Blot Overlay技术,将纯化获得的GST与GST-Fibulin-4蛋白倍比稀释杂交到PVDF膜上,经过His-VP7,His-VP56蛋白的孵育,结果表明随着杂交的蛋白量从低到高,蛋白信号由弱到强,His-VP7与His-VP56都能够吸附于GST-Fibulin-4蛋白上并发生相互作用,而不能吸附GST蛋白。利用Pull Down技术,裂解细胞表达的GFP蛋白与GFP-Fibulin-4蛋白,结合His-VP7,His-VP56的HisPur Cobalt Resin,在Elution中均能检测到GFP-Fibulin-4蛋白质,而检测不到对照蛋白质GFP,进一步证实了VP7,VP56与Fibulin-4蛋白之间的相互作用。