pH对香菇多糖含量及合成关键酶基因转录水平的影响

香菇是一种药食两用真菌,其主要代谢产物香菇多糖具有较高药用价值,研究香菇多糖代谢途径对提高香菇多糖含量具有较大参考价值。以香菇新808为材料,苯酚-硫酸法测定不同pH发酵条件下香菇多糖的含量,通过荧光定量PCR及3个软件(GeNorm、NormFinder和BestKeeper)筛选出了不同pH条件香菇稳定表达的内参基因,并以此为基础分析多糖代谢途径中3个关键酶基因的转录表达水平。结果表明,在实验用pH值范围内(5.0-7.0),香菇菌丝体生物量和胞内多糖含量随着pH值的升高而增加,而胞外多糖含量则呈下降趋势;18S和rpl4分别被鉴定为不同pH发酵条件下最稳定和最不稳定表达的内参基因。不同pH发酵条件UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGP)的相对表达量明显高于葡萄糖磷酸变位酶基因(PGM)与葡萄糖磷酸异构酶基因(PGI);PGM相对表达量小且稳定,PGI相对表达量较小,但随pH值的变化波动较大。不同pH对香菇生物量及多糖含量的影响存在差异,3个关键酶基因的转录表达水平与多糖含量之间无明显相关性。     

外源茉莉酸甲酯诱导对香菇多糖代谢及关键酶基因表达的影响

香菇多糖是重要的生物活性成分,其药用价值高,茉莉酸甲酯有助于提高食用菌多糖含量,但关于其对香菇多糖合成的影响尚不清楚。本研究以香菇新808为实验材料,对不同浓度茉莉酸甲酯（MeJA）诱导下香菇菌丝生物量和生长速率、香菇多糖代谢关键酶活性及基因相对表达量、香菇多糖含量进行比较分析。结果表明：10μmol/L的茉莉酸甲酯可显著促进香菇菌丝生长并提高菌丝体生物量,分别是对照的1.14倍、1.2倍;与香菇多糖代谢相关的UDP-葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）、葡萄糖磷酸异构酶（PGI）、α-葡萄糖磷酸变位酶（α-PGM）活性增加,为对照组的1.58、1.13、3.21倍;其基因相对表达量较对照组也显著上调,为对照组的5.73、1.4、1.77倍;香菇多糖合成量显著增加,为对照组1.58倍。10μmol/L的MeJA处理后,香菇多糖代谢关键酶活性及基因相对表达量与多糖含量间存在显著的正相关关系,表明添加适宜浓度的茉莉酸甲酯会影响香菇菌丝的生长及多糖合成。     

层次化教学在“微生物学”课程中的应用

“微生物学”是高等农业院校的专业基础课。当前,农业院校专业类群复杂,学生个体差异很大,社会竞争力较弱。针对上述问题,基于专业特色和培养目标的差异,在教学大纲、教学内容、教学目标和考核方式等方面采取层次化设计,因材施教,充分发挥学生的能动性,提升教学效果,提高人才培养质量。     

硝普钠对香菇多糖代谢及关键酶基因表达的影响

香菇多糖是香菇中特有的生物活性成分。硝普钠在调控食用菌生长方面具有重要影响,但其对香菇生长及多糖合成的影响尚不清楚。本文以香菇新808为研究材料,通过添加不同浓度硝普钠作为外源一氧化氮对新808菌丝的生物量、生长速率、香菇多糖含量、香菇多糖代谢关键酶活性及其表达调控基因相对表达量进行综合研究。结果表明：硝普钠浓度为100 μmol/L可显著提高香菇菌丝生物量,与对照组相比增加了1.61倍;生长速率与对照组无显著差异;香菇菌丝的香菇多糖含量显著提高,为对照组的3.71倍;漆酶、锰过氧化物酶和木质素过氧化物酶活性显著提高,分别为对照组的1.73倍、2.23倍和1.55倍;与多糖合成有关的辅助模块酶基因LENED_010207、碳水化合物结合模块基因LENED_012941和多糖裂解酶基因LENED_004566基因相对表达量有所上调,其中LENED_010207基因上调最明显,而多糖合成关键酶基因UDP-葡萄糖焦磷酸化酶基因(UGP)、葡萄糖磷酸变位酶基因(PGM)与葡萄糖磷酸异构酶基因(PGI)相对表达量均显著下调。在100 μmol/L浓度硝普钠处理下,香菇生物量、多糖含量、多糖代谢关键酶活性及部分多糖合成关键酶的基因相对表达量均显著高于对照组,表明添加适宜浓度的硝普纳能有效地促进香菇多糖的合成,提高香菇多糖的含量。本文为进一步探索香菇多糖的代谢通路提供了理论依据,为选育高多糖含量的香菇新品种提供了新思路,对改进香菇栽培技术有一定的参考意义。     

不同浓度Fe~(2+)和Cu~(2+)胁迫对灵芝寡肽转运蛋白基因家族的转录表达水平的影响

前期研究发现在Fe~(2+)和Cu~(2+)胁迫下,OPT基因转录表达水平会有较大的变化。为进一步探究这两种金属对OPT基因的影响,分析了不同浓度Fe~(2+)和Cu~(2+)胁迫下灵芝寡肽转运蛋白基因家族的转录表达水平。以灵芝荣保1号为实验材料,设置不同浓度梯度(0、50、100、200和400 mg/L)Fe~(2+)和Cu~(2+)进行液体静置培养,分别于15 d和30 d收集样品,测定生物量和多糖含量,利用实时荧光定量PCR技术分析OPT基因的转录表达水平。结果表明,Fe~(2+)对灵芝的生长有一定的促进作用,Cu~(2+)则对其有抑制作用。两种金属在实验用的浓度范围内对于灵芝多糖含量在培养前期表现出抑制作用,后期则有一定的促进作用。除未检测到转录本的3个OPT基因(OPT7、OPT8和OPT9),其余OPT基因的转录表达均有差异性。培养前期(15 d),Cu~(2+)胁迫下OPTs基因表达水平较低且差异不明显,Fe~(2+)胁迫下OPTs基因表达水平差异较大;培养后期(30 d),Cu~(2+)胁迫下OPTs基因表达水平较15 d的样品明显增加,且存在差异,Fe~(2+)胁迫下绝大多数OPTs基因均在浓度为200 mg/L下转录表达水平最高。实验证明,不同浓度Fe~(2+)和Cu~(2+)对灵芝的生物量与多糖含量存在不同程度的影响,同时OPT基因在转录水平上也做出了不同的响应,表明其在灵芝适应与吸附外界金属离子的过程起到了重要的作用。     

金属胁迫下灵芝寡肽转运蛋白基因家族的转录表达

【目的】寡肽转运蛋白(Oligopeptide transporters,OPTs)通过细胞质膜,将细胞外环境中的物质转入细胞内,从而参与各种生理活动。植物中OPTs蛋白参与金属运输和分配,从而促进植物对金属的利用和适应,但真菌中OPTs是否参与这一过程的相关报道较少。探究OPTs是否在灵芝对金属的适应过程中发挥作用。【方法】以灵芝荣保1号为材料,利用平板实验分析不同浓度的Cu2+、Fe2+和Se4+对菌丝体生长和生物量的影响,并采用实时荧光定量PCR分析不同金属离子胁迫下,两个培养阶段(15 d和30 d)灵芝寡肽转运蛋白基因(OPTs)的转录表达水平。【结果】Cu2+、Fe2+和Se4+三个金属离子在实验使用的浓度范围内抑制灵芝菌丝体的生长量和生物量,且在相同处理条件下的生长量与生物量的变化趋势相同。荧光定量PCR结果显示,除未检测到转录本的3个基因(OPT7、OPT8和OPT9),其余10个基因均表现出了差异性表达模式。在培养前期(15 d),有6个寡肽转运蛋白基因(OPT1、OPT3-6和OPT10)的相对表达量在Cu2+的胁迫下发生上调,而在Fe2+和Se4+的胁迫下,所有的OPTs基因的表达量均被下调。在培养后期(30 d),Se4+胁迫下的OPTs基因的表达量仍旧被下调,而Cu2+和Fe2+的胁迫下表达量均显著上调。【结论】金属能够在不同的程度上影响灵芝的生长量和生物量,同时寡肽转运蛋白基因对这些金属胁迫在转录水平上做出了响应,表明寡肽转运蛋白基因可能在灵芝对金属的适应过程中发挥作用。     

大肠杆菌细胞周质底物结合蛋白gsiB基因的克隆及其表达条件的优化

为深入研究大肠杆菌谷胱甘肽转运系统的蛋白质结构和功能, 对该系统中的gsiB基因进行了克隆和表达条件的优化。根据大肠杆菌谷胱甘肽转运系统中底物结合蛋白gsiB基因序列, 利用PCR方法扩增到该基因的编码区序列, 利用SLIC (Sequence and ligation–independent cloning)方法直接将其插入pWaldo-GFPe中, 成功构建了重组表达质粒pWaldo-GFP-GsiB。将重组质粒转化不同的大肠杆菌表达菌株进行诱导表达, 通过改变培养温度和IPTG浓度等条件, 得到了能够大量表达目标蛋白的重组子。结果表明: 大肠杆菌BL21(DE3)是 gsiB基因表达的最佳宿主菌; 18℃低温诱导培养有利于gsiB基因的大量表达; 0.1 mmol/L IPTG足够诱导gsiB基因表达, 增加IPTG浓度(0.1 mmol/L~1.0 mmol/L)并不能明显地促进gsiB基因的表达。Western blotting结果显示目标蛋白质有表达, 其分子量大小与预期相符。