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郭霄  史硕博 《微生物学报》2024,64(3):882-892
【目的】与整合型表达载体相比,游离型表达载体通常具有更高的拷贝数以实现目标基因的高强度表达,并且对于DNA操作应用更加方便和灵活。然而,目前的研究尚未确定适用于圆红冬孢酵母的游离型质粒,该酵母外源基因的表达或者基于CRISPR/Cas9的基因组编辑都需要通过整合方式来完成,这也是对其遗传改造进展缓慢的一个重要原因。本研究目的是构建圆红冬孢酵母的游离型质粒,使得其外源基因的表达和基因组编辑更方便省时。【方法】首先对圆红冬孢酵母苯丙氨酸氨裂解酶基因(phenylalanine ammonia-lyase gene, PAL)中可能存在的自主复制序列(autonomously replicating sequences, ARSs)进行挖掘和表征,将该基因及其上下游序列进行分段扩增,构建到带有β-异丙基苹果酸脱氢酶基因(β-isopropyl malate dehydrogenase gene, LEU2)的质粒中,通过电转化的方法导入LEU2基因缺陷的圆红冬孢酵母中,根据转化效率高低鉴定了该酵母的一个ARS。其次,以编码香叶基香叶基焦磷酸合成酶(geranylgeranyl pyrophosphate synthase, GGPPS)的BTS1基因为敲除靶点,将其gRNA构建到基于ARS的游离型质粒中,通过转化子直观的颜色变化来验证该游离型质粒是否成功应用于圆红冬孢酵母的CRISPR/Cas9体系。【结果】本工作鉴定了圆红冬孢酵母的ARS,构建了基于ARS元件的游离型质粒,并将该质粒应用于圆红冬孢酵母CRISPR/Cas9体系,成功实现了基于游离型质粒的基因敲除。【结论】本研究丰富了圆红冬孢酵母现有的工具库,为圆红冬孢酵母的合成生物学应用提供了良好的研究基础和技术支持。  相似文献   
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转录组平台技术及其在代谢工程中的应用   总被引:4,自引:0,他引:4       下载免费PDF全文
组学技术在系统水平上对细胞代谢进行全面的分析,极大地促进了代谢工程的发展和应用。全基因组水平的转录分析可以使研究者更加精确地评估细胞表型,加深对细胞代谢的理解。而且转录组分析也有助于研究者鉴定菌种改良的目标基因,加速对微生物细胞工厂的合理设计及构建。文中介绍了3种主要转录组平台技术的原理,并总结了转录组学在代谢工程领域中应用的最新进展和未来发展趋势。  相似文献   
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