鞭毛蛋白FliC突变体/HPV 18 L2N融合蛋白的表达与纯化

目的:人乳头瘤病毒(HPV)的持续性感染导致女性宫颈癌的发生。HPV的次要衣壳蛋白L2可以诱发交叉中和多种型别HPV的中和抗体,但是单独免疫L2诱发的抗体滴度较低。鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白FliC是一种有效的佐剂。删除FliC超变区域的突变体可与外源抗原融合表达并且显著增强外源抗原特异性抗体的产生。本研究旨在构建鞭毛蛋白FliC超变区删除突变体与HPV 18 L2N(aa.13-154)的融合基因,通过大肠杆菌原核表达系统表达FliC突变体与HPV 18 L2N的融合蛋白并纯化,为研究鞭毛蛋白的佐剂活性及新型HPV 18L2疫苗奠定基础。方法:以鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白编码基因fliC为模板,通过重叠PCR法构建删除fliC D3区域(fliC△D3)、D3+CD2a区域(fliC△D3CD2a)、D3+D2区域(fliC△D2D3)的突变体,同时将HPV 18 L2N基因插入置换突变体的超变区删除区域。含有重组基因的表达载体在大肠杆菌中诱导表达,经SDS-PAGE及Western blot鉴定分析。表达的融合蛋白经Ni-Sepharose亲和层析纯化及Q-Sepharose离子交换层析去除内毒素。纯化后的融合蛋白经Native-PAGE鉴定分析,通过鲎试剂凝胶法测量蛋白溶液中的内毒素含量。结果:构建了pET22b-fliC△D3/18 L2N、pET22b-fliC△D3CD2a/18L2N、pET22b-fliC△D2D3/18 L2N重组载体。重组载体在大肠杆菌以包涵体形式高效表达,且主要以单体形式存在。结论:通过原核表达及层析法纯化,成功获得了无热源、高纯度的鞭毛蛋白FliC突变体与HPV 18 L2N的融合蛋白,为增强HPV L2免疫原性提供了一种新的途径,为进一步研制HPV 18 L2疫苗奠定了基础。     

鞭毛蛋白FliC突变体／HPV18L2N融合蛋白的表达与纯化

目的：人乳头瘤病毒（HPV）的持续性感染导致女性宫颈癌的发生。HPV的次要衣壳蛋白L2可以诱发交叉中和多种型别HPV的中和抗体,但是单独免疫L2诱发的抗体滴度较低。鼠伤寒沙门氏茵鞭毛蛋白FliC是一种有效的佐剂。删除FliC超变区域的突变体可与外源抗原融合表达并且显著增强外源抗原特异性抗体的产生。本研究旨在构建鞭毛蛋白FliC超变区删除突变体与HPV18L2N（aa．13—154）的融合基因,通过大肠杆菌原核表达系统表达F1ic突变体与HPV18L2N的融合蛋白并纯化,为研究鞭毛蛋白的佐剂活性及新型HPV18L2疫苗奠定基础。方法：以鼠伤寒沙门氏菌鞭毛蛋白编码基因fliC为模板,通过重叠PCR法构建删除fliCD3区域（fliCAD3）、D3＋CD2a区域（fliCAD3CD2a）、D3＋D2区域（fliCAD2D3）的突变体,同时将HPV18L2N基因插入置换突变体的超变区删除区域。含有重组基因的表达载体在大肠杆菌中诱导表达,经SDS—PAGE及Westernblot鉴定分析。表达的融合蛋白经Ni—Sepharose亲和层祈纯化及Q-Sepharose离子交换层析去除内毒素。纯化后的融合蛋白经Native—PAGE鉴定分析,通过鲎试剂凝胶法测量蛋白溶液中的内毒素含量。结果：构建了pET22b．fliCAD3／18L2N、pET22b—nic△D3cD2a／18L2N、pET22b—fliCAD2D3／18L2N重组载体。重组载体在大肠杆菌以包涵体形式高效表达,且主要以单体形式存在。结论：通过原核表达及层析法纯化,成功获得了无热源、高纯度的鞭毛蛋白FliC突变体与HPV18L2N的融合蛋白,为增强HPVL2免疫原性提供了一种新的途径,为进一步研制HPV18L2疫苗奠定了基础。     

人乳头瘤病毒(HPV)31型中和单克隆抗体的制备及性质鉴定

目的:构建获得HPV31构象依赖的中和单抗。方法:采用昆虫细胞表达的HPV31 L1VLP(virus-like particle, VLP)免疫BALB/c小鼠,取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,收集杂交瘤细胞培养上清,首先采用HPV31 VLP-ELISA及HPV31假病毒中和实验筛选分泌HPV31中和单抗的杂交瘤细胞株,然后纯化单克隆抗体,分别采用假病毒中和实验及ELISA实验对纯化后单克隆抗体进行鉴定,包括抗体的亚型及其结合表位的构象特征、针对HPV31的中和IC50及针对HPV16、HPV18、HPV33、HPV45、HPV52、HPV58、HPV6、HPV11的交叉中和活性。结果:筛选获得9株HPV31构象依赖中和单抗,其中3株HPV31特异性中和单抗中有2株的IC5010 ng/mL,分别是XM31-13(0.36,Ig G1)及XM31-23(7.10,Ig G1),6株交叉中和单抗中亦有2株的IC5010ng/mL,分别是XM31-19(7.14,Ig G1)、XM31-20(6.91,Ig G1)。结论:获得的9株HPV31构象依赖的中和单抗,特别是其中4株单抗IC50值10 ng/mL的4株单抗,可用于含HPV31L1VLP多价疫苗的质控疫苗的研究。     

HPV18 L2保守中和表位肽协同MF59与CpG-ODN免疫可诱发广谱中和抗体反应

摘要 目的：人乳头瘤病毒(HPV)次要外壳蛋白L2保守中和表位肽可诱发交叉中和抗体,研究L2保守中和表位肽免疫原性的特点利于HPV通用疫苗的研发。HPV18是第二常见的优势流行高危型,但18L2保守表位肽的免疫活性未见报道。方法：本研究采用化学法合成HPV18 L2N端多肽(18RG-1)并偶联KLH获得18RG1-KLH肽;联合MF59/CpG-ODN复合佐剂或弗氏佐剂皮下免疫BALB/c小鼠5次,用假病毒中和实验检测抗血清针对α6、α7、α9及α11亚属中多个致癌型HPV的中和抗体。结果： MF59/CpG-ODN复合佐剂多肽组抗血清对所有6种检测型别的中和活性与弗氏佐剂多肽组的相当。MF59/CpG-ODN佐剂多肽组抗血清具有广谱中和活性,中和范围至少包括14种致癌型HPV,中和抗体滴度最高的为HPV45 (438)和HPV18 (325),其次为HPV68 (163)和HPV70 (150),这四种优势中和型别均为α7亚属。结论：首次发现HPV18 L2 RG1保守中和表位免疫血清可诱发广谱中和抗体反应 (其中对α7亚属的HPV中和活性最强,为优势中和型别)。研究结果为基于L2保守表位的广谱HPV疫苗研发奠定基础。     

一种可诱发高滴度的针对人乳头瘤病毒HPV16,HPV52,HPV58中和抗体反应的HPV16嵌合病毒样颗粒疫苗的研究

人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV)主要衣壳蛋白L1病毒样颗粒(VLP)主要诱发型别特异性中和抗体,增加L1VLP型别虽可扩大保护范围,但疫苗生产成本显著增加。HPV16,HPV52及HPV58是我国的主要高危型别。本文将HPV58次要衣壳蛋白L2aa.16～37多肽(与HPV52L2aa.16～37序列相同)插入HPV16L1的h4-βJ coil区,利用昆虫表达体系构建获得16L1h4-58dEVLP,协同人用佐剂氢氧化铝和单磷酰脂质A(Alum-MPL)免疫小鼠。活性检测结果显示16L1h4-58dE VLP免疫血清可中和17种HPV假病毒中的16种,其中针对HPV16的平均中和抗体滴度最高(滴度,76 800),与HPV16L1VLP对照组的相当(P0.05);重要的是,针对HPV58及HPV52的平均中和抗体滴度均大于10~3(分别为4 050和1 725);另外,还可中等滴度中和HPV45(550),HPV18(506),HPV33(500),HPV39(463),HPV68(431),HPV6(300),HPV57(150),HPV11(125)及较低滴度的中和HPV2/HPV27(40),HPV35(38),HPV5(25),HPV31(13),但对HPV59没有中和活性。因此,以本研究构建16L1h4-58dE VLP进行广谱HPV疫苗的研究,可望降低疫苗成本,具有应用前景。     

原核表达系统制备HPV58L1 VLP可诱发高滴度且持久的中和抗体

目的:采用大肠杆菌表达系统制备人乳头瘤病毒58型(human papillomavirus type 58,HPV58)病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)疫苗。方法:合成法获得HPV58 L1大肠杆菌密码子优化基因,构建HPV58 L1重组原核表达质粒mpET22b/HPV58 L1,检测其在BL21(DE3)中表达水平,饱和硫酸铵沉淀加阳离子交换层析法纯化蛋白后进行动态光散射(dynamic light scatter,DLS)分析。小鼠免疫后,检测免疫血清针对HPV58假病毒的中和抗体水平。结果:HPV58 L1蛋白在BL21(DE3)细胞中大部分以可溶形式表达,纯化获得的HPV58 L1蛋白可组装成水动力学直径约为74 nm的VLP。0.5μg的HPV58 L1 VLP可诱发小鼠产生高滴度的HPV58特异性中和抗体,可维持至少20周。结论:原核表达系统制备的HPV58 L1 VLP可诱发高滴度且持久的中和抗体,可用于成本低的HPV58疫苗的研究。