鸡氨肽酶H在大肠杆菌中的表达、纯化与部分酶学性质分析

氨肽酶H(Aminopeptidase H, APH))是生物组织内一种常见的氨基内肽酶, 但因为天然材料中含量很低, 基本无法深入研究其催化机理、功能与结构的关系及其在生物体内的确切功能。从鸡肝组织克隆了APH的全基因序列, 并把该序列亚克隆到载体pET22b(+)上, 然后转化大肠杆菌Rosetta(DE3), 构建了APH的表达菌株。该菌株经IPTG诱导, 在SDS-PAGE上明显出现一条与天然APH理论分子量一致的新增蛋白带, 该条带的浓度随着表达时间的延长逐渐加深; 6 h基本达到平衡, 此时重组蛋白占总蛋白的16.7%, 表达水平高达94.7 mg/L。对表达产物进行了活性检测、纯化和酶学性质分析, 发现重组蛋白在亚基构成, 热稳定性, 最适pH等方面与天然APH基本相同, 据此可以确认表达产物确实是APH, 发酵液总活力达到1636 u/L。这些结果为APH的催化机理及其在生物体内的功能的阐明奠定了重要的物质基础。     

不同生长阶段青枯菌的高效离子交换色谱表征

采用高效离子交换色谱和激光光散射仪对不同生长阶段的青枯菌进行色谱表征。青枯菌经过色谱分离得到3个特征峰。通过对延滞期、对数生长期和稳定期青枯菌细胞浓度、发酵液pH值、细胞表面黏附的胞外酸性多糖(EPSⅠ)含量与青枯菌色谱行为的关系研究,发现在8h时,青枯菌运动能力强,细胞表面EPSⅠ少,吸附力弱,绝大多数菌体直接随流动相流出形成峰1;随着培养时间延长,细胞表面黏附的EPSⅠ量增多,与树脂吸附力增强,保留时间延长。因此分析3个色谱峰的形成与青枯菌的运动性、以及细胞表面EPSⅠ与阴离子交换树脂的吸附作用有关。并通过比较3个色谱峰青枯菌细胞表面EPSⅠ含量的差异和观察青枯菌经过4%甲醛固定处理后色谱行为的变化加以进一步验证。高效离子交换色谱为细菌完整细胞的研究提供了一种新的分析方法。     

几种氨基酸在庆大霉素生产中作用的研究

庆大霉素是氨基糖苷类广谱抗生素,其不仅用于临床治病,而且广泛应用于畜牧业。由于其发酵周期长,产素率低,生产成本高,因此改进生产方法势在必行。本文报道了在绛红色小单孢菌产生庆大霉素的培养过程中,添加一定量的甘氨酸、蛋氨酸、赖氨酸、酪氨酸能够有效地提高微生物细胞的代谢能力,缩短发酵培养周期,提高产素率。本方法是在小试（摇瓶）成功基础上,用5L玻璃发酵罐运转一个多月,取一个月的平均罐批数据表明：新方法较原工艺发酵周期缩短30% ~45%,罐批产量增加14% 左右,产素率提高30 % ~95%（因菌种生产能力不同而异）,产品质量符合中国药典2000版（CP2000）、英国药典2000版（BP2000）、美国药典26版（USP26）,生产成本大幅度降低,具有很强的市场竞争力。     

青枯菌HPLC分析中样品制备方法的优化

本文研究了青枯菌细胞的制备方法对细胞生命活力和表面特性的影响。结果表明,在高效离子交换色谱分析（HPLC）中,采用5000×g离心10min收集菌体细胞、超纯水（＞16MΩ）悬浮和洗涤青枯菌、重复洗涤二次的制备方法,既可以避免培养基成分造成的干扰,又可以保持青枯菌细胞的生命活力和细胞表面的原有性质。     

TAT-PTD融合蛋白可能存在的跨膜递送作用机制

为探讨TAT-PTD融合蛋白的跨膜递送作用机制,采用DNA重组技术构建pGEX-TAT-GFP-表达质粒.在E.coli- BL21表达GST-TAT-GFP,并用谷胱甘肽(glutathione) Sepharose-4B亲和柱进行纯化.GST-TAT-GFP在不同条件下与细胞的作用结果表明,GST-TAT-GFP能有效进入HeLa、SMMC-7721、L-02和BEL-7402细胞,GST-TAT-GFP在递送时对时间和浓度有依赖关系.同时,温度对GST-TAT-GFP跨膜作用具有明显的影响,GST-TAT-GFP的跨膜作用受代谢抑制剂的影响很小,肝素的存在能明显抑制GST-TAT-GFP跨膜进入细胞的能力,GST-TAT-GFP对细胞活性没有影响.这些结果说明,TAT-PTD可能是通过与细胞表面的硫酸乙酰肝素等受体相结合介导融合蛋白跨膜递送进入细胞的.     

酶促水解大豆分离蛋白动力学模型的研究

本文对AS1.398中性蛋白酶在pH6.9和温度49℃条件下水解大豆分离蛋白的动力学机制进行了研究．结果表明：酶水解速率随水解反呈指数递减．为了解释实验结果,我们提出了如下假设：对底物而言水解反应终为零级反应,水解过程中由于游离酶攻击酶-底物中间络合物而造成的不可逆酶变性是一个二级动力学过程．在此基础上,由实验数据推导得到了描述AS1.398中性蛋白酶催化水解大豆分离蛋白的动力学方程,该方程可用于指导和优化酶解反应实验．     

TAT蛋白转导结构域介导融合蛋白在小鼠活体的跨膜递送作用

目的探讨跨膜递送短肽——TAT蛋白转导结构域(简称TAT)介导的与其融合的活性蛋白在活体的跨膜递送作用。方法以融合蛋白GST-TAT-GFP,GST-GFP-TAT和GST-GFP为研究模型蛋白,不经过蛋白质的变性处理、直接通过向小鼠腹腔注射和皮肤涂抹这两种含TAT的融合蛋白及作为对照的融合蛋白GST-GFP,一定时间作用后取体内器官和皮肤做冷冻切片,荧光显微镜检测这些融合蛋白的跨膜递送情况;并对分别融合在C端或者N端的TAT介导GFP在活体动物体内和皮肤的跨膜递送作用进行对比。结果腹腔注射实验结果表明,TAT可以介导不经过蛋白质的变性处理的融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT跨膜递送进入到小鼠的心脏、肝、肾、脾和肺,甚至脑组织;其中GST-GFP-TAT跨膜递送效率比GST-TAT-GFP更高。结构模拟分析提示GST-GFP-TAT与GST-TAT-GFP中的TAT的暴露情况不同可能是造成两种蛋白跨膜递送活性差异的重要因素。皮肤实验的结果则表明TAT不仅介导融合蛋白GST-TAT-GFP和GST-GFP-TAT进入小鼠表皮,而且使其进入小鼠皮肤的真皮层。结论 TAT可以跨膜递送不经过变性处理的融合蛋白进入小鼠皮肤和体内,递送效率可能与TAT的暴露程度相关;这些结果为在蛋白质疗法方面应用TAT提供了进一步的理论依据。     

局部应用PTD-SOD、SOD对小鼠皮肤创伤的抗氧化应激损伤保护效果及其比较

目的探讨局部应用PTD-SOD、SOD对小鼠皮肤创伤的抗氧化应激损伤保护效果及其差异。方法制备机械性创伤小鼠模型和不同浓度的PTD-SOD(1000、3000、6000 U)及SOD(1000、3000、6000 U)溶液,分别用上述溶液进行治疗,同时设立模型对照组和生理盐水对照组,各组均连续治疗13 d。观察各组创伤愈合情况,记录创伤愈合率和愈合天数;于创伤后第14天取各组小鼠创伤愈合部位皮肤,一部分制成10%组织匀浆液用于检测抗氧化酶(SOD、CAT、GSH-Px)活性及丙二醛(MDA)、羟脯氨酸(Hyp)含量,一部分制成病理组织切片用于皮肤组织学观察。结果①与模型对照组相比,PTD-SOD各组或SOD各组的抗氧化酶活性和Hyp含量显著(P0.05)或极显著(P0.01)升高,MDA含量显著(P0.05)或极显著(P0.01)降低,能显著(P0.05)或极显著(P0.01)提高创伤愈合率、缩短创伤愈合时间;与生理盐水对照组相比,结果类似。②在同等剂量下,从促创伤愈合时间、抗氧化酶活性、MDA含量、Hyp含量等方面比较,PTD-SOD组明显(P0.05)或极明显(P0.01)优于SOD组。③适当剂量的PTD-SOD促创伤愈合效果优于高剂量PTD-SOD的促创伤愈合效果。结论 PTD-SOD或SOD在皮肤创伤治疗中具有良好的抗氧化应激损伤效果,这种保护效果在创伤愈合的早期最显著;同等剂量下,PTD-SOD在促创伤愈合的效果上明显优于SOD。     

青枯菌细胞表面的疏水性

分别采用BATH和HIC方法测定青枯菌细胞表面疏水性(CSH), 并比较菌液与正十二烷比例(BATH方法)和菌液上样量(HIC方法)对CSH测定结果的影响。确定在BATH方法中菌液(OD₆₀₀=0.5)与正十二烷的比例为2:1, HIC方法中菌液(OD₆₀₀=1.0)上样量为0.2 mL; 在此条件下, BATH和HIC两种方法之间呈现出良好的线性关系(r=0.99)。进一步采用HIC方法测定青枯菌在生长过程中CSH的变化情况, 结果显示随培养时间的延长, CSH逐渐降低, 24 h后CSH趋于稳定, CSH与青枯菌细胞表面的EPSⅠ (胞外酸性多糖)含量呈负相关。3株不同致病强度的青枯菌的试验结果进一步验证了青枯菌细胞表面的CSH随EPSⅠ含量的增加而降低。     

Tat蛋白转导区域位于融合蛋白C端时的跨膜递送作用

对Tat蛋白转导区域(PTDTat)的C端融合蛋白的跨膜递送作用进行探讨.采用DNA重组技术将PTDTat融合在绿色荧光蛋白(GFP)的羧基(C)端,构建重组表达质粒pGEXGFPTat,IPTG诱导其表达后,采用谷胱甘肽Sepharose4B(GS4B)亲和层析,获得纯化的谷胱甘肽S转移酶(GST)融合的重组蛋白GSTGFPTat.该蛋白与HeLa细胞共培养,荧光显微镜观察其荧光强度随着蛋白浓度的增高而增强.流式细胞仪分析发现,在4.0μmolL蛋白浓度下,转导效率高达80.0%;而在GFP氨基(N)端含有PTDTat的融合蛋白GSTTatGFP的阳性对照组,转导效率只有32.9%.实验结果表明,C端融合的PTDTat同样具有对外源蛋白的跨膜递送作用.该结果可能为PTDTat在蛋白药物递送方面的有效应用提供理论依据.