新冠病毒主蛋白酶小分子抑制剂荧光共振能量转移高通量筛选模型的优化与应用北大核心CSCD

基于荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)原理,以新冠病毒主蛋白酶(main protease, Mpro)为靶标,建立并应用Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型,以期快速筛选新型Mpro小分子抑制剂。利用大肠杆菌原核表达与分离纯化高活性的Mpro,再以FRET法进行比活力测定。基于FRET原理,以7-甲氧基香豆素-4-乙酸(7-methoxycoumarin-4-acetic acid, MCA)与2,4-二硝基苯酚(2,4-dinitropheno, Dnp)标记的多肽作为Mpro水解底物,通过优化反应缓冲液、Mpro反应浓度、反应温度与时间及DMSO耐受浓度,建立并应用Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型进行苗头化合物的筛选。利用大肠杆菌实现了高活性Mpro的原核表达与分离纯化,且比活力不低于40 000 U/mg。通过一系列优化实验,使用0.4μmol/L Mpro与5μmol/L底物建立了Z′因子值为0.79的Mpro小分子抑制剂FRET高通量筛选模型,且反应体系中含有的二硫苏糖醇(1,4-dithiothreitol,DTT)是影响FRET筛选模型可靠性的重要因素。通过对天然产物化合物库进行高通量筛选,发现白花丹素与银杏酸在体外对Mpro酶活性具有良好的抑制作用。本研究建立了基于FRET原理的Mpro小分子抑制剂高通量筛选模型,初步证实了白花丹素与银杏酸是一类新型苗头化合物,为抗新型冠状病毒药物先导化合物的筛选与发现奠定了基础。     

利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除TrxR1基因的HCT-116细胞株北大核心CSCD

为更好地研究靶向硫氧还蛋白还原酶1的小分子化合物的细胞内靶点选择性,利用CRISPR/Cas9系统构建稳定敲除TrxR1基因(编码硫氧还蛋白还原酶1)的HCT-116细胞株。首先根据TrxR1基因序列和CRISPR/Cas9靶点设计原则,设计并选择合适的敲除位点,再根据敲除位点序列设计敲除TrxR1基因的sgRNA干扰序列,以pCasCMV-Puro-U6空质粒载体为骨架构建能表达该sgRNA干扰序列的重组质粒。质粒共转染至HCT-116细胞后,利用嘌呤霉素筛选TrxR1敲除的HCT-116细胞,通过DNA测序、免疫蛋白印迹、TRFS-green荧光探针和细胞内TrxR1酶活力检测等方法鉴定和验证HCT-116细胞的TrxR1基因敲除效果。进一步通过CCK-8实验初步研究靶向TrxR1小分子化合物对细胞内TrxR1酶活力和细胞增殖力抑制的相关性。结果显示,表达sgRNA干扰序列的重组质粒可以敲除HCT-116细胞中TrxR1基因,筛选获得的稳定敲除细胞HCT116-TrxR1-KO中无TrxR1蛋白表达,而靶向TrxR1小分子抑制剂对该细胞无TrxR1酶活力和细胞增殖力抑制效果。本研究利用CRISPR/Cas9系统成功构建了HCT-116的TrxR1基因敲除的稳定细胞株,为进一步研究TrxR1在相关疾病的发生机制和治疗中的作用奠定了基础。     

水飞蓟宾抑制TNF-α诱导的MMP-9在胃癌细胞中的表达

目的确定在胃癌细胞株中水飞蓟宾对TNF-α诱导的MMP-9表达的影响。方法应用细胞增殖分析、化学抑制剂处理、免疫印迹、流式细胞分析、腺病毒转移等技术完成实验。结果在SNU216和SNU668胃癌细胞中,MMP-9mRNA和蛋白的表达都被TNF-α剂量依赖性地提高。另-方面,TNF—α诱导的MMP-9表达被水飞蓟宾剂量依赖性地抑制。结论在胃癌细胞中水飞蓟宾可减少TNF-α诱导的MMP-9表达。     

新型冠状病毒主蛋白酶抑制剂的筛选方法研究进展

新型冠状病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)席卷全球,具有较高的传染性和死亡率,但目前尚缺乏安全有效的COVID-19疫苗与治疗药物。新型冠状病毒主蛋白酶(main protease,Mpro)的进化高度保守,在调控新冠病毒RNA复制中具有重要的生物学功能,已成为新型广谱抗冠状病毒药物开发的理想靶标之一。简便、快速、灵敏、经济的药物高通量筛选模型的建立是高选择性Mpro抑制剂高效筛选与开发的重要基础和关键技术。本文对Mpro分子结构及其抑制剂的筛选方法研究进展进行了综述和展望,以期为靶向Mpro广谱抗冠状病毒药物的筛选与开发提供有益的借鉴和参考。     

保罗样激酶1保罗盒结构域: 肿瘤治疗的新靶标

保罗样激酶1（Polo-like kinase 1, Plk1）与恶性肿瘤的发生与发展密切相关,被认为是肿瘤分子靶向治疗中最具潜力的重要靶标之一。目前,针对Plk1激酶结构域（Kinase domain, KD）设计Plk1抑制剂已成为研究热点,其中部分小分子抑制剂已进入Ⅰ/Ⅱ期临床研究并展现出良好的抗癌前景。尽管Plk1 KD结构域抑制剂具有一定的靶标选择性,但鉴于作为ATP结合口袋的KD结构域在众多激酶结构中的高度保守性和易导致交叉耐药等问题,这使开发高选择性的Plk1 KD结构域抑制剂面临极大的挑战。保罗盒结构域（Polo-Box domain, PBD）作为Plk1特有的底物结合域,在调控Plk1的亚细胞定位中具有重要功能,被认为是未来高选择性Plk1抑制剂开发的理想靶标。文中对Plk1 PBD的分子结构、生物学功能和相关抑制剂的研究进展进行了综述和展望,以期为靶向Plk1 PBD结构域抑制剂的分子设计提供有益的借鉴和参考。     

榆林地区生态系统弹性力评价分析

区域生态系统的弹性力研究是目前生态环境健康评价的重要指标,它反映了生态系统在偏离平衡状态后恢复到初始状态的自我调节和自我恢复的能力。以陕西省榆林市1区11县的生态系统各项指标现状为研究依据,综合运用了Fragstats和Arc GIS软件对榆林地区生态系统弹性力的各项参数进行计算,评价和分析了12个县(区)生态系统弹性力的时空演变与分布特征。结果表明:1995—2010年榆林地区生态系统弹性力呈平稳上升趋势,生态系统的自我调节能力和抗干扰能力不断增强。1995年榆林地区生态系统弹性力值低于0.4的地域面积所占比例为100%,截至2010年该数值降至41.45%,且主要集中在北部风沙草滩区。整体而言,榆林地区生态系统弹性力呈现南高北低的格局,大于0.6的区域主要集中在清涧、吴堡、绥德和米脂四县。研究揭示了榆林地区生态系统弹性力的发展变化趋势,以期为研究区的生态健康诊断与可持续发展决策提供参考。     

新型三明治样荧光偏振筛选模型在新型冠状病毒主蛋白酶小分子抑制剂筛选中的应用北大核心CSCD

新型冠状病毒主蛋白酶(main protease, Mpro)通过水解多聚蛋白质体(polyprotein)调控病毒基因组RNA复制,且人体不存在其同源蛋白酶,这使Mpro成为抗新型冠状病毒药物开发的理想靶标之一。本研究基于荧光偏振技术(fluorescence polarization,FP)和生物素-亲和素反应(biotin-avidin system, BAS)原理,成功地建立了三明治样荧光偏振筛选模型用于Mpro小分子抑制剂的快速筛选。通过对天然产物化合物库进行高通量筛选,发现了漆树酸(anacardic acid,AA)是Mpro的竞争型抑制剂,1,2,3,4,6-O-五没食子酰葡萄糖(1,2,3,4,6-O-pentagalloylglucose,PGG)是Mpro的混合型抑制剂,且已报道的部分抑制剂是非特异性Mpro小分子抑制剂。文中建立的三明治样荧光偏振筛选模型具有良好的简便性、灵敏性和稳定性,初步证实了漆树酸和PGG是一类新型苗头化合物,建立科学严谨的活性评价体系对于抗新型冠状病毒药物的筛选与发现是至关重要的。     

基于β-catenin/Lef1相互作用为靶标的新型抗肿瘤药物高通量筛选模型的建立

旨在以β-catenin/Lef1相互作用为靶标,建立基于ELISA原理的适用于靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制剂筛选的高通量筛选模型。利用DNA重组技术,将构建的β-catenin-pET-30a(+)重组质粒转化大肠杆菌Escherichia coli Rosetta (DE3),经诱导培养后进行β-catenin原核表达。采用亲和层析方法分离纯化β-catenin后,以GSTPulldown实验进行生物学活性鉴定。利用ELISA原理建立β-catenin/GST-Lef1结合的分子模型,通过优选GST-Lef1最佳包被浓度和β-catenin最佳反应浓度,建立适用于靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制剂筛选的高通量筛选模型。SDS-PAGE和Western blotting实验证实β-catenin的原核表达。GST Pulldown实验证实纯化的β-catenin具有良好的生物学活性。通过对基于ELISA原理建立的β-catenin/GST-Lef1结合的分子模型优化,选用10μg/mL GST-Lef1和6μg/mLβ-catenin建立ELISA高通量筛选模型,其Z?因子为0.76。本研究成功建立了基于ELISA原理的β-catenin/GST-Lef1结合的分子模型,为靶向β-catenin/Lef1相互作用小分子抑制剂的高通量筛选奠定了基础。     

人源抗ICAM-1单链抗体的制备及其生物学活性鉴定

利用噬菌体展示技术筛选特异性人源抗ICAM-1单链抗体（Anti-human ICAM-1 scFv）并进行生物学活性鉴定。应用Tomlinson I+J噬菌体抗体库,以P1抗原肽为包被抗原,经过4轮“吸附-洗脱-扩增”进行亲和富集筛选。以PCR反应、ELISA抗原交叉反应和Dot blotting实验进行阳性克隆的鉴定。scFv经原核表达和分离纯化后,以Western blotting实验、竞争ELISA实验和细胞黏附抑制实验对其生物学活性进行初步鉴定。Tomlinson I+J噬菌体抗体库经4轮亲和富集筛选,利用ELISA方法成功筛出4株阳性克隆。通过PCR鉴定反应、ELISA抗原交叉反应和Dot blotting实验,最终获得了1株既能与P1抗原肽特异结合又能与人ICAM-1抗原特异结合的阳性克隆J-A1。对scFv进行原核表达和亲和层析后获得了高纯度的目的蛋白。竞争ELISA实验和细胞黏附抑制实验证实纯化的scFv具有良好的亲和活性和抗细胞黏附活性。文中成功利用噬菌体展示技术筛选到特异性人源抗ICAM-1 scFv,为进一步探索该抗体在炎症相关性疾病治疗中的应用奠定了基础。     

靶向β-catenin/TCF4相互作用小分子抑制剂酶联免疫吸附法高通量筛选模型的优化与应用

在经典的Wnt/β-catenin信号通路中,β-catenin/TCF4 (T-cell factor 4) 相互作用在非小细胞肺癌 (Non-small cell lung cancer,NSCLC) 的生长分化、化疗耐药、转移复发等过程中发挥着重要的促进作用,已成为新型靶向性抗NSCLC转移药物开发的理想靶标之一。为了高效地发现抑制β-catenin/TCF4相互作用的苗头化合物,本研究在应用酶联免疫吸附实验 (Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA) 原理的基础上,通过优化GST-TCF4 βBD包被浓度和β-catenin反应浓度,建立ELISA高通量筛选模型并成功应用于苗头化合物的筛选。ELISA筛选模型优化实验结果表明,选用2 μg/mL GST-TCF4 βBD和0.5 μg/mL β-catenin建立ELISA高通量筛选模型,其Z′因子值为0.83,并成功筛选到具有良好抑制活性的白花丹素 (Plumbagin)。肿瘤细胞增殖实验结果表明,白花丹素对A549、H1299、MCF7和SW480细胞具有明显的细胞毒性。TOPFlash实验结果证实,白花丹素对转染的HEK293细胞内β-catenin介导的转录活性具有显著的抑制作用,β-catenin/TCF4相互作用可能是白花丹素抗癌活性的潜在分子靶标之一。文中以β-catenin/TCF4相互作用为靶标,通过系统的实验优化方案,成功地建立了适用于药物高通量筛选的ELISA筛选模型,为高效筛选靶向β-catenin/TCF4相互作用的小分子抑制剂奠定了实验基础。