环磷酰胺辅助化疗对不同年龄乳腺癌患者卵巢功能的损伤情况及机制研究

目的:以月经变化情况及血清激素水平为观察指标,探讨环磷酰胺辅助化疗方案对绝经前不同年龄段乳腺癌患者卵巢功能的损伤情况及可能的机制研究。方法:收集2017年1月至2018年12月期间在我院接受环磷酰胺辅助化疗的绝经前乳腺癌患者77例。患者年龄范围为26-48岁,并按年龄分为两组:≤35岁组为16例;>35岁组为61例。调查研究两组患者化疗前后的月经情况,以及血清激素水平(E、FSH、AMH)。同时进行动物实验,采用单剂量环磷酰胺(200 mg/kg)处理不同月龄组(3月龄和6月龄)雌性C57BL/6J小鼠,每组小鼠12例。在环磷酰胺处理前及处理后一周,检测小鼠血清AMH水平,计数小鼠卵巢卵泡数量。结果:环磷酰胺化疗后,>35岁组与≤35岁组间比较,>35岁组闭经率更高,复经率更低,血清AMH和E2水平下降幅度更大(P<0.05),FSH水平升高幅度也大于≤35岁组,但差异无明显统计学意义(P>0.05)。不同年龄组内比较,≤35岁组患者化疗后的血清AMH和E2下降水平无明显差异(P>0.05);血清FSH水平明显升高(P<0.05)。而>35岁组的患者化疗后,血清AMH和E2水平明显下降,FSH水平明显升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。不同月龄组小鼠环磷酰胺处理前后,血清AMH水平明显下降,卵巢原始卵泡和生长卵泡数明显较少,差异均有统计学意义(P<0.05),且6月龄组小鼠下降程度更明显(P<0.05)。结论:环磷酰胺辅助化疗方案明显损伤患者卵巢功能,且对年龄越大者损伤程度越严重,更易导致不可逆性卵巢损伤。     

促性腺激素释放激素类似物缓解环磷酰胺导致卵巢损伤的机制研究

目的:通过动物实验和细胞实验初步探索促性腺激素释放激素类似物在环磷酰胺暴露下保护卵巢功能的机制。方法:构建乳腺癌荷瘤小鼠36只,随机分成Control组,CTX组和CG(CTX+GnRHa)组,药物干预后麻醉下剥离肿瘤和子宫卵巢并称重,计数卵巢原始卵泡和生长卵泡数目,提卵巢蛋白进行Western blot检测抗缪勒氏管激素(Anti-Müllerian hormone,AMH)蛋白表达量,提取卵巢RNA进行qRT-PCR实验检测mRNA水平,心尖取血检测血清AMH水平。卵巢颗粒细胞加药处理36小时后,收细胞蛋白进行Western blot检测AMH蛋白表达量,提细胞RNA进行qRT-PCR检测mRNA水平,ELISA法检测细胞培养基上清中AMH水平。结果:成瘤后第21天,CTX组和CG组小鼠肿瘤质量无统计学差异(P>0.05)且均小于Control组(P<0.05);CTX组子宫和卵巢的总重量均显著低于Control组和CG组(P<0.01),卵巢内原始卵泡数量均低于Control组和CG组(P<0.001),生长卵泡数量无统计学差异(P>0.05)。动物实验,Western blot结果提示,CTX组卵巢AMH蛋白含量显著高于Control组或CG组(P<0.05);由ELISA结果提示,CTX组血清AMH蛋白浓度显著低于CG组(P<0.01)。细胞实验,由Western blot可见,CTX组AMH蛋白含量显著高于Control组和CG组(P<0.05);由ELISA实验可见,CG 750组和CG1000组培养基上清的AMH蛋白浓度均高于对应CTX剂量组(P<0.01)。无论在动物实验还是细胞实验中,各组AMH的mRNA表达水平均无统计学差异(P>0.05)。结论:在CTX化疗的同时运用GnRHa,可以在不干扰化疗疗效的前提下,通过减少CTX所致细胞内AMH潴留程度,增加细胞外和血清中的AMH浓度从而发挥保护卵巢储备的功能。     

SETD8基因表达对乳腺癌细胞周期、活性氧及药物敏感性的影响

目的:构建SETD8重组慢病毒载体,探讨SETD8对人乳腺癌细胞周期、氧化应激的影响,并观察稳定敲低SETD8后对乳腺癌细胞多西他赛敏感性的影响。方法:构建含SETD8基因的重组慢病毒载体,经转染,荧光显微镜观察感染效率;采用RT-qPCR和Western blot检测SETD8 m RNA和蛋白相对表达量;采用流式细胞技术检测细胞周期及活性氧水平,通过CCK-8试剂检测稳定敲低SETD8基因的乳腺癌细胞对多西他赛的敏感性变化。结果:成功包装慢病毒,荧光观察慢病毒感染效率在85%左右,通过PCR和WB验证SETD8过表达及敲低稳转细胞系的效率显著(P0.01)。低表达SETD8的乳腺癌细胞周期停滞在G2/M和S期,细胞内ROS水平高于对照组。不同浓度多西他赛处理的SETD8敲低稳转细胞系的细胞活性较对照组明显降低(P0.01)。结论:慢病毒介导下调SETD8表达,使得乳腺癌细胞周期阻滞在G2/M期,细胞内ROS增多,与多西他赛发生协同作用,从而增加了药物敏感性。