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以琥珀酸放线杆菌Actinobacillus succinogenes F3—21为出发菌株,分别用吖啶黄、紫外线、紫外线.硫酸二乙酯和亚硝基胍进行诱变,产生突变菌库。用“96孔板培养-HPLC浓缩检测-厌氧瓶复筛”的模式筛选高产突变株。从1056株突变株中,筛选到一株高产菌株Ⅵ-10-C。连续传代10次,产酸水平不变。在5L发酵罐中补料分批发酵72h,Ⅵ-10-C产琥珀酸87.6g/L,生产强度1.22g/(L·h),糖酸转化率0.66g/g;琥珀酸产量比出发菌提高了30%。代谢通量与关键酶活性分析表明:相比于F3-21,Ⅵ-10-C发酵过程中从磷酸烯醇式丙酮酸节点处流向草酰乙酸的代谢流量增加了28.9%,相对应的磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶(PEPCK)酶活提高了23.5%。结果表明用“96孔板培养-HPLC浓缩检测-厌氧瓶复筛”的模式能快速有效筛选高产琥珀酸菌株。 相似文献
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耐温性L-谷氨酸发酵菌种的选育 总被引:1,自引:0,他引:1
应用基因组改组技术提高,L-谷氨酸生产菌在高温发酵条件下的谷氨酸产量。以天津短杆菌T6—13变异株SW07-1为原始亲株,分别经紫外线(UV)-硫酸二乙酯(DES)和X射线诱变,获得5株耐温性能略有提高的突变菌株。经2轮基因组改组,获得耐高温(能在44℃生长)的L-谷氨酸菌株F2-50。F2—50在38℃下,摇瓶发酵40h,发酵液中L-谷氨酸浓度比原始出发菌株提高了近41%,在41℃高温下,摇瓶发酵40h,L-谷氨酸浓度比原始出发菌株提高了近2倍。 相似文献
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将变形假单胞菌的精氨酸脱亚胺酶(ADI)编码基因arc A克隆至具有阿拉伯糖启动子的分泌型表达载体pBAD/gⅢB中,经鉴定得到重组质粒pBAD-ADI。将重组质粒转化大肠杆菌TOP10F'后进行诱导表达,分别考察了不同诱导物L-arabinose浓度、诱导温度、诱导时间对重组蛋白表达的影响,最适诱导条件为L-arabinose浓度0.002%(w/v),25℃下诱导5 h,全细胞的酶活为68 mU/mL(指单位发酵液体积,下同)。采用Osmotic Shock法使ADI从胞周质释放出来,经检测分泌到胞周质的重组蛋白活性为53 mU/mL,细胞内的酶活为34 mU/mL。SDS-PAGE分析显示,重组蛋白大小约为46 kD。 相似文献
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arcA基因提高大肠杆菌对有机溶剂的耐受性 总被引:1,自引:0,他引:1
【目的】将来源于恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida JUCT1)的基因arc A(编码精氨酸脱亚胺酶)整合到Escherichia coli JM109(DE3)基因组中,以提高该菌对有机溶剂的耐受性。【方法】以P.putida JUCT1的基因组为模板扩增基因arc A,并与p ET-20b(+)连接后导入E.coli JM109(DE3)中,验证该基因提高E.coli JM109(DE3)对有机溶剂的耐受性。利用Red同源重组的方法将arc A整合到E.coli JM109(DE3)基因组中。【结果】E.coli JM109(DE3)/p ET-20b(+)-arc A在添加了2.0%(体积比)环己烷、0.1%(体积比)甲苯、4.0%(体积比)萘烷和0.1%(体积比)丁醇的培养基中培养8 h后,其OD660由初始的0.2分别上升到0.8、0.9、1.8和1.3。将arc A成功整合到E.coli JM109(DE3)基因组中,获得了具有较好遗传稳定性的溶剂耐受E.coli JM109(DE3)宿主菌株。【结论】外源基因arc A能提高大肠杆菌菌株的有机溶剂耐受性,为工业化应用中耐溶剂微生物菌株的构建提供了实验依据和理论基础。 相似文献
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染料木素及其单糖苷衍物在食品和医药领域具有重要作用,但难溶于水的特性极大地限制了其应用范围,研究表明糖基化反应可有效提高其水溶性。文中针对来源于软化芽孢杆菌的环糊精葡萄糖基转移酶,研究其对染料木素单糖苷衍生物槐角苷的糖基化反应。通过对D182位点的定点饱和突变,突变酶D182C较WT转化率提高了13.42%,主要糖基化产物(槐角苷单糖苷、二糖苷、三糖苷)分别提高了39.35%、56.05%和64.81%。酶学性质研究发现,D182C较WT的环化、水解、歧化活力均有所提高。且最适pH和温度分别为6和40℃。动力学研究发现,D182C针对底物(糖基供体和受体)的Km值较WT均有所降低,且催化效率kcat/Km则明显提高,说明D182C对底物的亲和力相较于WT有大幅提升。同源建模及分子对接结果表明,突变酶D182C糖基化效率提高的原因可能与底物作用力增加有关。 相似文献
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酶水解菊芋糖浆发酵生产琥珀酸的初步研究 总被引:6,自引:1,他引:5
用产菊粉酶的一株黑曲霉菌株进行产酶发酵条件和水解条件研究,在30℃,pH 6.0,摇床转速200 r/min,发酵时间为3 d的最适产酶条件下,酶活可以达到45.9 U/mL.以总糖含量为85.2 g/L的菊芋粉为初始底物,最适酶水解条件为温度50℃,加黑曲霉培养液的量为10%(v/v),水解12 h后,水解率达到99.6%.用此酶解液在5 L搅拌发酵罐中进行琥珀酸发酵,初始还原糖浓度53.5 g/L,36 h发酵产琥珀酸43.8 g/L,琥珀酸产率0.83 g/g,糖利用率99.0%,琥珀酸生产强度1.22 g/(L·h). 相似文献
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从实验室保藏的菌株中筛选获得Candida sp.PT2A,并通过18S rRNA鉴定为安大略假单胞菌Candida on-tarioensis。对C.ontarioensis不对称还原合成(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的发酵产酶条件和转化条件进行优化,确定了最适的发酵产酶条件和转化条件:温度30℃,初始pH 6.5,摇床转速180 r/min,菌体质量浓度200 g/L。采用2-氯-1-(3-氯苯基)乙酮质量浓度为10 g/L时,还原反应72 h,(R)-2-氯-1-(3-氯苯基)乙醇的e.e.值为99.9%,产率为99%;底物质量浓度提高至30 g/L时,产率下降为84.3%。采用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)对C.ontarioensis细胞进行通透性处理(CTAB g/L,4℃下处理20 min),在30 g/L底物下反应24 h,产物的e.e.和产率分别达到99.9%和97.5%。 相似文献
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琥珀酸是一种用于合成树脂、可降解塑料及许多化学中间体的重要绿色化工原料。为了提高琥珀酸的发酵产率, 基于Actinobacillus succinogenes的代谢流量分布情况对其育种机制进行了研究。以Actinobacillus succinogenes CGMCC1593为原始菌株进行NTG诱变, 挑选在含有50~100 mmol/L氟乙酸平板生长较快的菌落, 经过初筛和复筛, 发现SF-9菌株产生更多琥珀酸且积累乙酸较少。以50 g/L的葡萄糖为碳源, 在5 L发酵罐上进行分批发酵, 该菌株发酵32 h时琥珀酸产量(34.8 g/L)提高了23.4%, 琥珀酸/乙酸比率为9:1, 副产物乙酸量比原始菌株降低了约50%。代谢流量分析(MFA)结果表明, PEP是影响琥珀酸合成的关键节点, PYR是影响乙酸等杂酸生成比例的关键节点, 并且这两个节点均非刚性节点。通过氟乙酸抗性诱变, 成功地筛选出了流向乙酸、甲酸和乳酸等杂酸的流量相对减少, 而流向琥珀酸的流量明显增强的突变菌株SF-9。 相似文献