大豆异黄酮代谢途径在大肠杆菌中的构建及表达

自然界异黄酮合成途径主要存在于豆科植物中。以微生物为宿主研究异黄酮代谢,则需要将整个相关代谢途径的多酶体系组装到工程菌种,从而进行表达及代谢研究,这就需要用到多基因的转化和共表达技术。综合应用了多基因单载体和多基因多载体方法,将大豆异黄酮代谢途径中的五个关键酶基因导入到大肠杆菌中,对异黄酮代谢途径在大肠杆菌中的构建和表达进行了研究和探索,获得了含有五个外源基因的重组大肠杆菌;重组菌经IPTG诱导,以L-酪氨酸为底物进行发酵,发酵产物经过HPLC测定,结果表明和空白对照相比有新的代谢产物生成,初步断定为异黄酮类化合物。     

大豆异黄酮代谢途径在大肠杆菌中的构建及表达

自然界异黄酮合成途径主要存在于豆科植物中。以微生物为宿主研究异黄酮代谢,则需要将整个相关代谢途径的多酶体系组装到工程菌种,从而进行表达及代谢研究,这就需要用到多基因的转化和共表达技术。综合应用了多基因单载体和多基因多载体方法,将大豆异黄酮代谢途径中的五个关键酶基因导入到大肠杆菌中,对异黄酮代谢途径在大肠杆菌中的构建和表达进行了研究和探索,获得了含有五个外源基因的重组大肠杆菌;重组菌经IPTG诱导,以L-酪氨酸为底物进行发酵,发酵产物经过HPLC测定,结果表明和空白对照相比有新的代谢产物生成,初步断定为异黄酮类化合物。     

拟南芥WUSCHEL蛋白的原核表达、亲和纯化和多克隆抗体制备

本研究构建了带有His标签的拟南芥(Arabidopsis thaliana)WUSCHEL基因原核表达载体pET-31b(+)-WUS-His(6),优化了大肠杆菌(Escherichia coli)诱导表达体系,将亲和层析纯化后的WUS融合蛋白,经尿素梯度透析复性溶解,免疫新西兰大白兔,成功制备了WUS蛋白多克隆抗体。通过琼脂糖免疫扩散检测确定了抗血清效价和特异性,并以斑点杂交和Western blotting检验其灵敏性。结果表明,成功构建的拟南芥WUS原核表达载体,在E.coli中以0.5mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)28°C诱导表达10h后,融合蛋白得到高水平表达,亲和纯化后目标蛋白纯度达96%以上,所制备的多克隆抗体具有较高特异性和灵敏性,可用来检测纳克级蛋白抗原。