绿色荧光蛋白分裂肽基因重组乙型肝炎病毒复制子模型的建立

为构建一种重组乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)复制子模型,使其能够在病毒感染的细胞中表达可视化报告基因蛋白,本研究删除HBV基因组核心蛋白(HBV core, HBc)编码区部分序列,构建HBV1.1-ΔHBc113复制子载体。利用内含肽(intein)介导蛋白拼接的特性,选取加强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)和超级折叠绿色荧光蛋白(super folder green fluorescent protein, sfGFP)作为外显肽,建立EGFP^N1-8/EGFP^C9-11和sfGFP^N1-10/sfGFP^C11蛋白分裂系统。基于ΔHBc113载体,分别构建EGFP^C9-11和sfGFP^C11重组HBV复制子;应用DNA印迹法(Southern blotting)验证两种rHBV载体的细胞内复制能力。结果显示,构建的HBV1.1-ΔHBc113复制子载体能够在HBc反式互补条件下在转染细胞中形成病毒复制。构建的EGFP^C9-11和sfGFP^C11重组HBV复制子能够支持HBc互补条件下的细胞内病毒复制,并产生子代病毒颗粒;HBV重组复制子表达的EGFP^C9-11或sfGFP^C11蛋白在共表达氮端蛋白EGFP^N/sfGFP^N细胞中,通过intein介导的蛋白质高效拼接,能够形成完整的、有功能的GFP。结果表明,构建的荧光蛋白重组HBV复制子系统能够为HBV高通量药物筛选和HBV易感性研究提供实验工具,具有重要的病毒学意义和应用前景。     

血清MUC1、SCD-1、NLRP3在溃疡性结肠炎患者中的表达与凝血功能异常的相关性

摘要 目的：探讨与分析血清粘蛋白1（MUC1）、硬脂酰辅酶A脱氢酶-1（SCD-1）、含NLR家族PYRIN域蛋白3（NLRP3）在溃疡性结肠炎患者中的表达与凝血功能异常的相关性。方法：2019年8月到2021年7月选择在本院诊治的溃疡性结肠炎患者78例作为病例组（包括轻度组患者50例与中重度组患者28例）,同期选择在本院进行体检的健康人员78例作为对照组,检测三组血清MUC1、SCD-1、NLRP3水平与凝血指标,同时进行相关性分析与影响因素分析。结果：三组的血小板计数（PLT）、平均血小板体积（MPV）、血红蛋白（HGB）对比无差异（P>0.05）。中重度组与轻度组的血清MUC1、SCD-1、NLRP3含量高于对照组,中重度组高于轻度组（P<0.05）。中重度组与轻度组的部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶原时间（PT）低于对照组,纤维蛋白原（FIB）高于对照组,中重度组与轻度组对比也存在差异（P<0.05）。在病例组中,Pearson 分析显示血清MUC1、SCD-1、NLRP3表达水平与凝血指标存在相关性（P<0.05）。Logistic多元回归方程显示MUC1、SCD-1、NLRP3等都为影响患者病情活动度的重要因素（P<0.05）。结论：溃疡性结肠炎患者多伴随有血清MUC1、SCD-1、NLRP3的高表达,也多伴随有凝血功能异常,MUC1、SCD-1、NLRP3表达与凝血功能异常存在相关性,也是影响患者病情活动度的重要因素。     

一种基于荧光qPCR检测新型冠状病毒核酸的优化反应体系的建立及相关测试

为实时并快速地检出SARS-CoV-2冠状病毒RNA,对基于荧光定量聚合酶链式反应(Polymerasechain reaction,PCR)的反应体系进行了优化。结果表明,按照本实验提供的方法操作后,检测SARS-CoV-2冠状病毒所用的RNA样本的最小浓度稀释度可调至1/10000(初始值设为10ng/μL)。且用于检测COVID-19临床阳性样本所测得循环值(Cycle threshold,Ct)均低于35或40。其灵敏性测试结果也表明该方法的敏感性较好。同时在同等条件下,与目前市场上的COVID-19试剂盒的检测结果基本一致,并且检测循环数缩短2个单位。因此,本实验所建立的体系适用于前期临床诊断的筛查工作,为在医学上实现快速诊断提供了工具。     

一种基于琼脂糖凝胶电泳法检测SARS-CoV-2的新方法

鉴于琼脂糖凝胶电泳分析方法的准确、快速、简便等特性,优化后可以做为检出COVID-19病原的新方法。在不影响结果判读的情况下,通过对扩增时间及检测样本浓度进行优化,以达到预期目的。结果表明,检测SARS-CoV-2的最优反应程序为94℃预变性3 min;94℃变性时间、56℃退火时间及72℃延伸时间均降至5 s,且进行35个循环;最后72℃孵育5 min,最优模板用量比例(初始值设为4 ng)下限调整在(1:1 000)～(1:5 000)范围内。阳性样本测试结果符合预期。建立了一种简便、省时,适用于检测低载量病毒样本的新方法,为临床提供诊断参考。