全局转录机器工程——工业生物技术新方法

美国和英国的研究人员在2006年1月出版的<科学>杂志上发表文章称: 工业生物技术是一种新的工业制造概念……并将成为一种新的制造技术典 范①.采用以微生物酶或细胞为主体的工业生物技术生产大宗化学品和能源、材料、医药产品,已经成为全世界--尤其是我国解决资源、能源和环境危机的重要手段②.     

产腈水解酶菌株的诱变及培养优化

对实验室保存的1株产腈水解酶的Rhodococcus rhodochrous菌株采用氯化锂进行诱变处理,筛选得到了1株产酶活力较高的菌株tg1-A6。经过优化得到培养基的配方为(g.L-1):葡萄糖10,谷氨酸钠10,酵母膏3,己内酰胺7,MgSO40.5,K2HPO40.75,KH2PO40.75。当培养温度28℃,摇床转速200 r.min-1,初始pH值7.0,通过补加葡萄糖,该菌的腈水解酶酶活可达到26.77 U.mL-1。     

三角酵母D-氨基酸氧化酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达

从三角酵母中提取总RNA ,反转录后进行PCR扩增得到D 氨基酸氧化酶 (D AminoAcidOxidase ,DAAO)基因 ,经测序可知 ,与文献中三角酵母的DAAO基因序列的同源性在 99%以上。将DAAO基因用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切后 ,与相同酶切的大肠杆菌表达载体pET 2 8a连接 ,转化大肠杆菌TOP 1 0F′,并筛选得到重组质粒pET DAAO ,转化BL2 1 (DE3)感受态细胞 ,得到重组大肠杆菌BL2 1 (DE3) pET DAAO。对重组大肠杆菌中的D 氨基酸氧化酶进行了诱导表达 ,考察了诱导温度、菌浓度、诱导剂IPTG用量以及溶氧等因素对酶活的影响。结果表明 ,在 2 8℃、菌浓度 (OD6 0 0 ) 1 0、IPTG浓度 1mmol L时 ,DAAO酶活最高达 2 3 3U mL。研究进一步显示 ,用廉价无毒的乳糖可以替代IPTG进行诱导 ,当乳糖浓度为 2mmol L ,DAAO酶活可达 2 2 7U mL。经过补料分批培养和乳糖诱导 ,DAAO酶活可以达到 1 75U mL。     

腈水合酶基因克隆与调控表达的研究进展

微生物腈水合酶作为新型生物催化剂得到日益广泛的应用 ,但野生菌株本身存在的酶稳定性差等问题制约了这一绿色工艺的发展 ,基因工程菌为解决这个难题开辟了新的思路。总结了各种菌株中腈水合酶的序列研究进展 ,虽然基因序列和蛋白序列同源性不高 ,但它们都以基因簇的形式存在 ,并具有相同的活性中心序列。归纳了克隆并表达腈水合酶基因的基本步骤和方式 ,并提出几种有效增强重组腈水合酶活性表达的方法。     

高效测定发酵液中透明质酸含量的改良CTAB浊度法

透明质酸（HA）在保健品、化妆品及临床医疗等领域都具有重要应用,发酵法是HA生产的主要方法。发酵液中HA含量的快速、准确测定对于HA的生产具有重要意义。在原始十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）浊度法测量HA浓度的基础上,提出了去除HA与乙酸缓冲液混合后的水浴步骤、降低CTAB试剂浓度（2.5 g/L）以及确定HA-CTAB络合反应时间（5 min）的改良CTAB法。进一步研究了发酵液各成分对改良CTAB方法的干扰,结果表明,葡萄糖、阿拉伯糖、D 葡萄糖酸前体等对CTAB浊度法没有干扰,但Mg2+等具有较为明显的干扰。通过冰乙醇沉淀与改良CTAB浊度法的耦合,实现了发酵液中HA含量的高效测定。     

产GL-7-ACA酰化酶重组大肠杆菌的构建和表达

为了实现GL-7-ACA酰化酶在大肠杆菌中的成功表达,将GL-7-ACA酰化酶基因用PCR的方法去除其信号肽序列,并将其连接到质粒pET-28a,通过筛选得到了表达GL-7-ACA酰化酶的重组菌B121(DE3),pET-ACY。分别考察了诱导温度、菌浓(OD600)、诱导剂IFrG的用量等因素对重组菌表达GL-7-ACA酰化酶的影响。在优化条件下,GL-7-ACA酰化酶酶活可达266U／L。GL-7-ACA酰化酶经一步DEAE-Sepharose纯化即可达到80％的纯度,酶活收率为50％。     

利用基因工程菌VG1(pTU14)产聚β-羟基丁酸酯的研究

本文对透明颤菌血红蛋白基因 (vgb)和λ噬菌体裂解基因 (S RRz)在不同宿主大肠杆菌中的外源表达及其在聚β 羟基丁酸酯 (PHB)生产中的应用进行了研究。实验结果表明 ,同时携带vgb、S RRz和 phbCAB三种基因的产PHB基因工程菌VG1 ( pTU1 4) ,经过 82h的摇瓶补料分批培养 ,菌体浓度可以高达 2 5 9g/L ,PHB百分含量则可在 52h时达到 95%以上 ;此外 ,该菌株不仅可以实现摇瓶高密度发酵培养和PHB产品的大量积累 ,还可以同时实现菌体细胞的可诱导裂解破壁 ,因此是一株具有潜在工业应用价值的多功能PHB生产菌株。     

利用基因工程菌VG1(pTU14)产聚β-羟基丁酸酯的研究

本文对透明颤菌血红蛋白基因(vgb)和λ噬菌体裂解基 因(SＲＲz)在不同宿主大肠杆菌中的外源表达及其在聚β羟基丁酸酯(PHB)生产中的应用进行了研究。实验结果表明,同时携带vgb、SＲＲz和phbCAB三种基因的产PHB基因工程菌VG1(pTU14),经过82h的摇瓶补料分批培养,菌体浓度可以高达25.9g/L,PHB百分含量则可在52h时达到95%以上;此外,该菌株不仅可以实现摇瓶高密度发 酵培养和PHB产品的大量积累,还可以同时实现菌体细胞的可诱导裂解破壁,因此是一株具有潜在工业应用价值的多功能PHB生产菌株。     

D-氨基酸氧化酶与麦芽糖结合蛋白和透明颤菌血红蛋白的融合表达

D-氨基酸氧化酶(DAAO)是一种重要的工业酶。为了进一步提高DAAO在大肠杆菌中的可溶性和活性表达, 分别构建了麦芽糖结合蛋白(MBP)和透明颤菌血红蛋白与三角酵母DAAO (TvDAAO) 的N-端融合蛋白。其中, MBP融合蛋白MBP-TvDAAO在组成型(JM105/pMKC-DAAO)和诱导型菌株(JM105/pMKL-DAAO)中表达时, 目标蛋白的可溶性表达量分别达到全细胞蛋白表达量的28%以上和17%左右, 比无MBP融合的对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO分别提高3.7和1.8倍; 但其酶活水平显著下降。VHb融合蛋白VHb-TvDAAO在重组菌BL21(DE3)/pET-VDAAO中摇瓶诱导表达时, DAAO酶活达到了3.24 u/mL, 比对照菌株BL21(DE3)/pET-DAAO提高了约90%。     

生物信息学在工业生物催化研究中的应用

随着石油等不可再生资源的日益减少以及环境污染问题的日益严重,应用工业生物催化技术改造或取代传统化工工艺已经成为新世纪化学工业可持续发展的研究热点。工业生物催化技术的研究对象是生物催化剂及其催化过程。近来,利用生物信息学技术进行工业生物催化研究已经越来越受到人们的重视。随着工业生物催化的发展,生物信息学将直接指导并加快新型高效生物催化剂的发现及功能改造进程。