双组分系统rcsC基因影响禽致病性大肠杆菌的致病性及相关生物学特性

【目的】双组分系统Rcs感受外界环境变化,并调控细菌的适应性及生存等。本文探讨Rcs双组分系统传感器激酶RcsC对禽致病性大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)相关生物学特性及致病性的影响。【方法】采用Red同源重组的方法构建rcsC基因缺失株,并利用互补质粒构建互补株,然后比较野生株、基因缺失株与互补株的生长特性、运动性、生物被膜、凝集沉淀能力、致病力及毒力基因转录水平的差异。【结果】rcsC基因缺失不影响APEC的生长速度,然而,缺失RcsC导致APEC的运动能力升高、生物被膜形成能力降低和凝集能力增强。凝集试验结果显示rcsC基因有助于APEC的凝集沉降。细胞黏附入侵结果表明,rcsC在APEC侵袭DF-1细胞过程中发挥作用,而对黏附能力无影响。动物感染试验结果表明rcsC基因缺失能显著降低APEC的毒力。荧光定量PCR检测结果表明,rcsC基因缺失株中ompA、aatA、fyuA和luxS基因的转录水平均显著降低,而fimC和tsh基因的转录水平显著升高。【结论】RcsC参与调控APEC的运动性、生物被膜形成、凝集沉降和致病力。     

禽致病性大肠杆菌毒力基因多重PCR方法的建立和应用

【目的】建立禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)黏附相关基因、侵袭及毒素相关基因、抗血清存活相关基因及铁转运相关基因的多重PCR方法,实现禽致病性大肠杆菌毒力基因的简便、快速检测。【方法】根据GenBank公布的基因序列,设计合成18对特异性引物,通过条件优化,建立四组多重PCR体系,并通过模板倍比稀释检测各组多重PCR的灵敏性。利用多重PCR检测100株APEC毒力基因的分布,验证多重PCR方法的可行性。【结果】根据PCR扩增片段大小判定,上述四组多重PCR体系均能同时扩增出该组中的各个毒力基因,且灵敏度分别为:103CFU、103CFU、105CFU、105CFU细菌和1ng、1ng、10ng、10ng DNA。100株APEC的毒力因子检测结果显示,多重PCR和单基因PCR结果一致。【结论】建立的四组多重PCR方法能够简便、快速地检测禽致病性大肠杆菌的毒力基因,可用于毒力基因的鉴定以及流行病学调查。     

禽大肠杆菌、肠炎、鼠伤寒、鸡白痢及鸡伤寒沙门菌多重PCR方法的建立及应用

【背景】大肠杆菌病和沙门菌病是最常见的家禽细菌性疾病,给养禽业造成严重经济损失。另外,禽大肠杆菌和沙门菌也是重要的人畜共患病原菌,可通过禽类及其产品传播给人类,对人类健康造成严重威胁。加强禽大肠杆菌和沙门菌的快速鉴别检测,对养禽业和公共卫生都具有重要意义。【目的】建立禽大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌的多重PCR检测方法。【方法】通过比较分析确定禽致病性大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌的特异靶标基因,设计5对特异性引物,通过条件优化建立多重PCR方法,分析该多重PCR方法的特异性、敏感性及可靠性。【结果】该方法能特异性地鉴定禽致病性大肠杆菌、肠炎沙门菌、鼠伤寒沙门菌、鸡白痢沙门菌和鸡伤寒沙门菌,每个PCR反应的最低检出限分别为103 CFU细菌和100 pg基因组DNA。临床分离菌株检测显示,多重PCR与传统血清学方法结果一致。【结论】建立的多重PCR方法能够快速鉴别禽致病性大肠杆菌和不同血清型沙门菌,对禽大肠杆菌病和沙门菌病的流行病学调查及临床检测具有重要意义。     

禽致病性大肠杆菌安徽分离株luxS和pfs基因的克隆、表达与细胞外合成AI-2 活性检测

【目的】LuxS/AI-2型密度感应系统存在于革兰氏阴性和阳性菌中,可产生用于细菌种间交流的通用自诱导信号分子AI-2(Autoinducer-2,AI-2),细菌许多生理功能都受此系统的调节。本研究开展对禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)自诱导信号分子AI-2的检测和建立体外合成、定量的方法,为进一步研究APEC的AI-2调控作用奠定基础。【方法】利用哈维弧菌BB170(Vibrio harveyi BB170)开展对APEC AI-2的检测;利用表达、纯化的LuxS和Pfs在体外催化S-腺苷同型半胱氨酸(Sadenosylhomocysteine,SAH),进行AI-2的体外合成。【结果】APEC能产生自诱导信号分子AI-2;成功表达可用于AI-2合成的可溶性重组蛋白LuxS和Pfs;纯化的重组蛋白LuxS和Pfs与SAH同时作用后,合成了浓度为300μmol/L的AI-2;运用哈维弧菌BB170对合成的AI-2活性检测表明,其活性是阴性对照的700倍。【结论】APEC存在LuxS/AI-2型密度感应系统,APEC的LuxS和Pfs可以在体外催化SAH生成有活性的AI-2分子。本研究为进一步研究APEC的AI-2的调控作用奠定基础。     

新城疫病毒P/V/W基因编码产物功能结构域的分析及定位

NDV的P基因能够通过RNA编辑机制编码3种病毒蛋白P、V和W。为了初步确定新城疫病毒P、V和W的功能结构域及其在P基因中位置,对这3种具有相同N端不同C端的病毒蛋白进行生物信息学分析。分别设计针对基因Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅶ型以及class Ⅰ NDV毒株P基因的引物。RT-PCR获得5种基因型NDV P基因的正确序列。通过核苷酸序列预测P基因表达产物的氨基酸序列,并进行二级结构预测和三级结构模拟。将SV5 V蛋白空间结构作为模板,从而分析获得了NDVP/V/W基因编码产物的二级结构以及部分空间结构。综合各种分析数据,预测P蛋白辅助N蛋白折叠的结构域位于N端前50 aa内;介导P蛋白四聚体形成的coiled-coil结构位于221-290 aa范围内;介导P蛋白与基因组的作用的X结构域位于291-392 aa范围内。V蛋白的C端结构域的编码区域位于P蛋白132-239 aa编码区域内。     

禽致病性大肠杆菌gspL基因缺失株构建及生物学特性

【目的】研究gsp L基因缺失对禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)生物学特性的影响。【方法】利用Red重组方法构建禽致病性大肠杆菌DE17株的gsp L缺失株;分析野生株与缺失株的生长特性、黏附和入侵DF1细胞的差异;采用荧光定量PCR的方法比较野生株和缺失株毒力基因转录水平的变化;比较野生株与缺失株的半数致死量(LD50)差异。【结果】gsp L缺失不影响DE17的生长特性,但其黏附和入侵DF1细胞能力显著下调。荧光定量PCR检测结果表明,缺失株毒力基因lux S,pfs,fyu A和iss转录水平明显上调,tsh的转录水平明显下调,而vat,ibe A,stx2f和omp A的转录水平无显著变化;LD50检测结果表明,缺失株比野生株毒力增强了12倍。【结论】gsp L基因的缺失不影响禽致病性大肠杆菌的生长特性,但能减弱其黏附和入侵能力,且可以正调控禽致病性大肠杆菌部分毒力基因的转录水平,推测gsp L基因可能与APEC对宿主的致病性有关。     

基于脂蛋白P80的滑液支原体抗体ELISA检测方法的建立及应用

【目的】研究滑液支原体(Mycoplasma synoviae, MS)脂蛋白P80的免疫反应性及其在MS血清抗体ELISA检测中的应用。【方法】对MSP80的氨基酸序列进行生物信息学分析、原核表达和纯化,并用免疫印迹法分析其与6种不同MS分离株阳性血清的免疫反应性以及与其他禽病原血清的交叉反应性;运用纯化的MS P80表达蛋白作为包被抗原建立了MS血清抗体的间接ELISA检测方法,对其敏感性和重复性进行检测;比较检测了与美国爱德士检测试剂盒对50份临床血清样品的阳性符合率。【结果】生物信息学分析预测MS P80蛋白为脂蛋白且含有信号肽,其在MS种内同源性高达98%-100%,与其他种属P80蛋白同源性在25%-34%之间,成功表达和纯化了MS P80重组蛋白(rMS P80);Western blotting分析表明纯化的rMS P80具有良好的免疫反应性和特异性;运用rMS P80建立的MS血清ELISA抗体检测方法可对不同株MS阳性血清进行抗体效价检测,而对其他禽病原阳性血清均无交叉反应性;该检测方法的批内变异系数小于5%,批间变异系数小于10%,重复性良好;与美国IDEXX检测试剂盒比较,本文建立的ELISA抗体检测方法敏感性更高,阳性符合率为75%,阴性符合率为89.47%,总样本符合率为86%。【结论】MS P80具有较好的免疫反应性、种内保守性和种间特异,并且可用作MS抗体检测的靶标抗原。     

一种基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性质粒的构建及应用

[背景]布鲁菌病是由布鲁菌感染引起的一种人兽共患传染病,对畜牧业发展和人类健康有着巨大的威胁。利用新型报告基因NanoLuc荧光素酶构建一种可以检测布鲁菌基因启动子活性的质粒,对于研究布鲁菌毒力基因的调控表达具有重要意义。[目的]制备NanoLuc荧光素酶多克隆抗体,构建一种基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性的质粒,并通过测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性验证该方法的可行性。[方法]构建NanoLuc荧光素酶原核表达载体pET-Nluc,纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体;以广宿主质粒pBBR1MCS为骨架,构建质粒pNluc、pBcsp31-Nluc和pVirB-Nluc,通过电转化构建S2308(Nluc)、S2308(Bcsp31-Nluc)和S2308(VirB-Nluc)重组菌株,在体外培养条件下测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性;比较分析virB启动子在胞内感染条件下和体外培养条件下的活性。[结果]通过原核表达获得NanoLuc荧光素酶重组蛋白,并制备得到效价高于1:100 000的多克隆抗体;成功构建pNluc、pBcsp31-Nluc和pVirB-Nluc质粒以及S2308(Nluc)、S2308(Bcsp31-Nluc)和S2308(VirB-Nluc)重组菌株;体外培养条件下测定bcsp31基因启动子和virB启动子活性,结果显示pNluc质粒可以精确报告其活性;测定virB启动子在胞内诱导条件下和体外培养条件下的活性,结果显示virB启动子活性在胞内感染条件下明显增强。[结论]构建了基于NanoLuc荧光素酶报告布鲁菌基因启动子活性的质粒,并验证其可以精确反映布鲁菌基因启动子活性,为研究布鲁菌毒力基因以及揭示其致病机制奠定了基础。     

AI-2对鸭疫里氏杆菌粘附入侵Vero细胞及其相关基因转录水平的影响

[目的]自诱导信号分子AI-2(Autoinducer-2,AI-2)作为细菌间的通用自诱导信号分子,参与细菌众多生理功能的调控.本研究通过开展AI-2在鸭疫里氏杆菌(Riemerella antatipestifer,RA)CH3株对非洲绿猴肾细胞(Vero细胞)的粘附、入侵以及对RA相关基因调控作用的研究,为进一步研究AI-2对RA的调控作用奠定基础.[方法]在CH3(血清型1型)对Vero细胞的粘附、入侵过程中加入不同浓度的AI-2,研究其对CH3粘附、入侵Vero的影响;在添加184.0 μmol/L AI-2的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)中培养RA CH3菌株,利用real-time PCR来检测AI-2对RA相关基因转录水平的影响.[结果]结果表明,AI-2浓度为18.4 μmol/L时,AI-2对CH3粘附Vero细胞的抑制性最强,为62％,当AI-2浓度为184.0μmol/L时,AI-2对CH3入侵Vero细胞的促进性最强为194％.荧光定量PCR结果表明AI-2对部分基因的转录有促进作用,对部分基因的转录有抑制作用.[结论]AI-2参与调控RA粘附、入侵Vero细胞及RA毒力因子、免疫原性蛋白基因以及代谢相关基因转录水平的调控.     

rmlA 基因缺失影响禽致病性大肠杆菌的生物被膜形成

【目的】构建禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)rmlA基因缺失株,研究该缺失株的生物学特性。【方法】利用Red重组系统构建rmlA缺失株;比较野生株与缺失株在生长特性、运动性和生物被膜形成能力等方面的差异;运用Real-time PCR技术,比较野生株与rmlA缺失株对APEC部分毒力基因转录的影响。【结果】rmlA缺失株,不影响APEC的生长和运动特性,但生物被膜形成能力显著增强,且使luxS、irp2基因转录水平分别上调2倍、1.8倍,iucD、fyuA则下调25倍。【结论】APEC的rmlA基因可以影响禽致病性大肠杆菌的生物被膜形成能力及部分毒力基因的转录水平;而对APEC的生长、运动特性没有影响。