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从海栖热袍菌中克隆出编码热稳定性的纤维素酶基因,以热激载体pHsh为表达质粒,构建重组质粒phsh—Ceff4,并转化至大肠杆菌中进行表达。基因表达产物通过热处理和离子交换层析,重组酶纯度达电泳纯。对纯化的重组酶酶学性质研究表明,最适反应温度85℃,最适反应pH4.6,pH4.5—6.0之间酶的相对酶活在80%以上。Co^2+对酶活性有促进作用,Ca^2+、Mg^2+、Zn^2+不影响酶活性,而Cu^2+、Ni^2+、Mn^2+对酶活性有抑制作用。 相似文献
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乙酰辅酶A被广泛应用到生物医学研究中,使用TPP代替昂贵的ATP为辅因子合成乙酰辅酶A受到广泛关注.新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)来源的丙酮酸:铁氧还蛋白氧化还原酶(TnPFOR)在大肠杆菌中进行了重组表达,分析了其酶学特性,并探讨了利用嗜热酶(TnPFOR)酶法合成乙酰辅酶A.采用pET-20b(+)载体,将新阿波罗栖热袍菌来源的四亚基组成的嗜热酶(TnPFOR)在大肠杆菌中进行异源表达;通过热处理和阴离子交换层析法纯化嗜热酶(TnPFOR);重组表达的嗜热酶(TnPFOR)的最适反应温度和pH分别为90℃和6.5,TnPFOR在90℃下孵育1h时保留了50%活性.利用嗜热酶(TnPFOR),以TPP为辅酶合成了乙酰辅酶A,并探讨了不同温度,丙酮酸钠底物浓度和反应时间对乙酰辅酶A合成的影响.得到的优化条件为:最适反应温度为90℃,丙酮酸钠浓度为1.5mmol/L,反应时间为2min. 相似文献
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在分子生物技术中,筛选标记基因是遗传转化载体所必备的基本元件之一,其主要功能是在基因操作中进行目标克隆的筛选,以及在应用过程中通过选择压力维持基因重组性状。抗药基因是微生物遗传转化中常用的筛选标记,大肠杆菌载体和一般穿梭载体中通常带有抗药基因。带有抗药基因的工程菌可以被广泛地应用于酶和有机化学品的发酵生产,因为工业发酵过程是在封闭系统中进行的,并且最终产品需要经过提炼。但是当人们需要用基因改良的菌株进行食品和饲料加工、环境修复、病虫害生物防治时,抗药基因类筛选标记应该被禁止使用。因此,发展生物安全性筛选标记成为遗传转化技术推广应用中的一个技术关键。本文介绍常用作筛选标记的抗药基因,以及针对抗药基因的安全性问题而发展的无选择标记的遗传转化技术及生物安全性筛选标记的基因工程技术。葡萄糖胺合成酶基因是近年发展起来的新型生物安全性筛选标记,它弥补了其他营养缺陷互补型和功能附加型筛选标记的缺陷,具有广阔的应用前景。 相似文献
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嗜热厌氧杆菌属(Thermoanaerobacter)来源的菌株作为一个高温发酵的细胞工厂,具有生产生物燃料和化学品的潜力,已引起了研究者的广泛兴趣。随着嗜热厌氧杆菌属来源的多个菌株全基因组测序的完成以及相关的生理生化实验的开展,建立一个简便、快捷的基因操作技术将有助于进一步深入理解和认识嗜热厌氧杆菌有关的代谢途径。最近,成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关系统(CRISPR/Cas)的基因编辑技术在嗜热菌中被开发应用。文中综述了嗜热厌氧杆菌的研究进展和热稳定性CRISPR/Cas9基因组编辑技术在嗜热厌氧杆菌的发展和建立,并对该编辑技术在其他嗜热菌未来发展的趋势提出参考意见。嗜热菌热稳定性的CRISPR/Cas9基因组编辑技术的建立和完善不仅可以促进嗜热菌遗传改造技术的发展,而且有助于提高嗜热菌遗传育种和代谢工程改造的效率。 相似文献
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当大肠杆菌所处的环境温度忽然升高时, 细胞体内会激发热激反应, 体内会迅速合成多种热激蛋白, 由热激转录因子调控的热激蛋白主要包括一些分子伴侣、蛋白降解酶、折叠辅助蛋白等。热激蛋白可以促进蛋白正确折叠, 降解错误折叠的蛋白。主要介绍大肠杆菌热激蛋白的表达调控及其功能, 利用热激转录因子发展的新型温控分泌表达系统及其在蛋白可溶性表达中的应用, 以及热激分子伴侣与重组蛋白共表达的研究进展。 相似文献
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将嗜热真菌毛壳菌纤维素酶Cel7A的纤维素结合结构域编码区与极端嗜热厌氧菌海栖热袍菌的纤维素酶CelB基因进行融合, 构建重组质粒pHsh-CBD-CelB, 并在大肠杆菌中表达。对融合蛋白进行纯化, 通过热处理和离子交换层析, 纯化到的融合蛋白SDS-PAGE 电泳图谱显示为单一条带。对融合蛋白的特性研究, 结果表明融合蛋白降解CMC的最适反应温度为90°C, 结晶纤维素吸附实验表明该融合蛋白具有结合结晶纤维素的能力, 并且融合蛋白降解CMC与结晶纤维素的能力得到提高。 相似文献
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