JSRV-Env诱导转染TC-1、TC-1-Hyal2细胞后对AKT和ERK表达的影响

为了探索JSRV与其受体相互作用后靶细胞的致瘤机制,本研究应用JSRV Env真核表达质粒分别诱导转染小鼠肺上皮细胞(TC-1)和稳定表达绵羊Hyal-2的小鼠肺上皮细胞(TC-1-Hyal2),而后检测细胞信号转导通路上AKT(丝氨酸/苏氨酸激酶)和ERK(细胞外信号调节激酶)在mRNA及蛋白水平上的表达变化,并分析绵羊Hyal-2在JSRV Env诱导TC-1细胞转化过程中的作用。首先体外培养TC-1和TC-1-Hyal2两种细胞,并分别设立pEGFP-C1-env转染组、pEGFP-C1转染组及未转染质粒组。通过实时荧光定量PCR和Western blot方法检测两关键酶在不同水平上的表达变化。qPCR结果显示:与未转染质粒细胞组比较,转染pEGFP-C1-env的两细胞组中AKT和ERK1/2mRNA表达均显著升高(P0.05)。Western blot结果显示:与未转染质粒细胞组比较,转染pEGFP-C1-env两细胞组中p-Akt(S473)蛋白表达量显著升高(P0.05);且p-Akt(T308)和p-Erk1/2蛋白在转染pEGFP-C1-env的TC-1细胞组中表达量也均呈显著升高变化趋势(P0.05),而这两种蛋白在相同处理的TC-1-Hyal2细胞组中表达量均呈极显著升高(P0.01)。此外,转染pEGFP-C1空载体的各细胞组与未转染质粒细胞组相比较AKT和ERK mRNA和蛋白含量差异均不显著(P0.05)。JSRV Env在诱导上述细胞系转化过程中,Ras-Raf-MAPK和PI3K-Akt两条细胞信号转导通路被激活;实验检测得知,转染pEGFP-C1-env的两细胞组中AKT、ERK表达量均升高;相比之下,在TC-1-Hyal2细胞组中其表达量升高更显著。研究结果推测绵羊Hyal-2在JSRV Env诱导TC-1细胞转化过程中起促进作用。     

绵羊肺腺瘤病毒内蒙古分离株前病毒全基因组克隆及序列分析北大核心CSCD

为了探究绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)内蒙古流行株与国际各代表株间的亲缘关系,本研究以内蒙古地区绵羊肺腺瘤病自然病例的肺组织总DNA为模板,克隆gag、pro与pol基因,并应用双酶切的方法将其与本实验室先期制备并保存的LTR、env基因连接起来,得到了含有JSRV内蒙古分离株前病毒全基因组重组质粒pMD-JSRV。序列分析结果表明,JSRV内蒙古分离株前病毒全基因组全长7 690bp,具外源性JSRV典型的分子特征:1在gag基因中含Sca I酶切位点;2核衣壳蛋白区有2个保守的可形成锌指结构的"CCHC"基序;3env基因编码的TM区胞浆尾部包含保守的特异性"YXXM"基序。将其进行同源性分析,结果表明该株病毒属JSRV-II型,与分离自美国的代表株AF105220间亲缘关系较近,同源性达95%。本研究为进一步探讨JSRV内蒙古分离株基因组结构特点与其致病机制间的关系奠定了基础。     

绵羊肺腺瘤病毒内蒙古分离株前病毒全基因组克隆及序列分析

为了探究绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV)内蒙古流行株与国际各代表株间的亲缘关系,本研究以内蒙古地区绵羊肺腺瘤病自然病例的肺组织总DNA为模板,克隆gag、pro与pol基因,并应用双酶切的方法将其与本实验室先期制备并保存的LTR、env基因连接起来,得到了含有JSRV内蒙古分离株前病毒全基因组重组质粒pMD-JSRV。序列分析结果表明,JSRV内蒙古分离株前病毒全基因组全长7 690bp,具外源性JSRV典型的分子特征:1在gag基因中含Sca I酶切位点;2核衣壳蛋白区有2个保守的可形成锌指结构的"CCHC"基序;3env基因编码的TM区胞浆尾部包含保守的特异性"YXXM"基序。将其进行同源性分析,结果表明该株病毒属JSRV-II型,与分离自美国的代表株AF105220间亲缘关系较近,同源性达95%。本研究为进一步探讨JSRV内蒙古分离株基因组结构特点与其致病机制间的关系奠定了基础。     

双峰驼NUCB2/Nesfatin-1抗体的制备及其表达分布北大核心CSCD

双峰驼(Camelus bactrianus)经过长期的自然选择,具备了许多特殊的生物学特性,比如极强的耐渴、耐饥饿以及适应恶劣气候等能力。Nesfatin-1是一种由82个氨基酸组成的肽,通过其前体物质NUCB2在Lys 83~Arg 84位点的前激素转化酶(PCs)的蛋白质水解而来,其可以调节机体的能量代谢效率,对食欲有抑制作用。研究双峰驼体内NUCB2/Nesfatin-1的分布与表达,以探究双峰驼体内是否具有特有的能量代谢方式,是否与其不会发生代谢性疾病有一定的联系。使用化学合成的方法合成双峰驼NUCB2/Nesfatin-1蛋白特定表位的半抗原多肽,使用马来酰亚胺法将半抗原与血蓝蛋白(KLH)偶联,通过免疫动物制备针对NUCB2/Nesfatin-1蛋白单一抗原表位的多克隆抗体,应用Western Blot方法检测NUCB2/Nesfatin-1蛋白在双峰驼下丘脑(弓状核、孤束核、腹内侧核)、前峰脂肪、后峰脂肪、胃(胃底腺周围组织)、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠、胰腺、肝以及腹部脂肪组织中的表达情况,使用荧光定量PCR技术检测NUCB2/Nesfatin-1 mRNA在双峰驼上述组织中的表达情况。结果采用GraphPad Prism 5.0软件的t检验分析。合成的双峰驼NUCB2/Nesfatin-1蛋白特定表位的多肽杂峰很少,经过计算其纯度大于95%。多肽的质荷比[M+4H]^(4+)和[M+3H]^(3+)符合预期。经过间接ELISA法测定制备的针对NUCB2/Nesfatin-1蛋白的多克隆抗体的效价为5.12×10^(5),成功制备多克隆抗体。使用制备的NUCB2/Nesfatin-1多克隆抗体检测双峰驼体内的NUCB2/Nesfatin-1蛋白的分布,其中,在双峰驼脂肪组织和胰腺组织中表达较为显著。荧光定量PCR检测双峰驼体内的NUCB2/Nesfatin-1 mRNA的分布,在所检测的组织中均有基因表达,其中,在腹部脂肪和肝组织的相对表达量较高。本研究通过分析抗原表位及合成多肽的方式,成功制备了针对双峰驼NUCB2/Nesfatin-1蛋白的特异性抗体,且该抗体的效价高、特异性强。通过成功制备的特异性抗体在蛋白层次上检测NUCB2/Nesfatin-1在双峰驼体内的分布情况,再使用荧光定量PCR方法在基因层次检测NUCB2/Nesfatin-1在双峰驼体内的分布情况。通过对结果的分析后发现,NUCB2/Nesfatin-1可能在双峰驼的耐渴、耐饥饿的机制调节中起到了抑制食欲的作用,使得双峰驼可以忍受长时间的饥饿,在双峰驼的外周脂肪组织中高表达,推测NUCB2/Nesfatin-1蛋白在双峰驼体内可能通过抑制脂肪细胞的分化,促进脂肪细胞中脂滴的水解为机体提供能量,其具体在脂肪细胞中的功能有待我们的进一步研究。