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1.
朱敦明  吴洽庆 《生物工程学报》2009,25(12):1770-1778
野生型生物催化剂对于其天然底物通常具有较好的反应活性和选择性,但生物催化剂在有机合成中应用时多数情况下是非天然底物,这就要求对野生型生物催化剂进行改造,以提高其对非天然底物的反应活性、稳定性和选择性(包括区域选择性和立体选择性)。以下根据酶催化剂的类型总结了近几年来通过基因工程改变生物催化剂的立体选择性的最新进展,盼望起到抛砖引玉的作用,以此促进我国在这一领域的快速发展。  相似文献
2.
以米曲霉(Aspergillus oryzae)RIB40基因组DNA为模版,通过PCR扩增其烯酮烯酯还原酶(AspER)基因(asper)后连接到表达载体pET32a(+)上,在大肠杆菌BL21(DE3)中以可溶形式表达。通过Ni-NTA亲和色谱层析纯化后,蛋白纯度提高1.9倍,回收率为60.62%。根据分子筛凝胶层析结果推算,AspER以二聚体形式存在。性质分析表明此酶为依赖于NADPH的氧化还原酶,最适pH为7.0~8.0,最适温度为40℃。对2-环己烯酮Km和kcat值分别为(2.45±0.36)mmol/L和(4.4±0.4)×103s-1。底物谱分析发现AspER对马来酰亚胺及其衍生物有较高的活性,其中对2-甲基马来酰亚胺的转化率和e.e.值均高于99%。  相似文献
3.
利用基因挖掘在数据库中发现一种来自Staphylococcus aureus N315的潜在DERA(SaDERA),将其基因密码子优化后实现了在大肠杆菌中的表达,重组酶经纯化后研究了其催化性质。结果表明:构建的工程菌具有较高的可溶表达量(占总蛋白的70%),通过简单的一步纯化即可得到电泳纯的酶;SaDERA是一种同源二聚体的酶(5.7×104),其最适反应条件是pH 7.7和45℃;SaDERA具有良好的碱耐受性,在pH 11.0、25℃的条件下温浴24 h后仍有93%的残余活力;SaDERA具有良好的乙醛耐受性,在0.3 mol/L乙醛浓度、25℃下,30 min内保持了70%以上的残余活力;乙醛连续自缩合产物被纯化并鉴定,所得产品为两次缩合产物。  相似文献
4.
通过基因数据挖掘方法(genome mining)获得了来源于固氮菌Herbaspirillum seropedicae SmR1中的腈水合酶基因hsn1。构建了hsn1/pETDuet-1/BL21的大肠杆菌共表达重组菌,经IPTG诱导获得了具有良好催化能力的Co^2+依赖型腈水合酶HSN1。利用全细胞反应研究了HSN1的底物谱,发现HSN1对底物3-(4-氯苯基)戊二腈有良好的区域选择性及一定的对映选择性,它可以选择性地水解1个腈基得到3-(4-氯苯基)-4-氰基丁酰胺,该化合物可通过一步化学反应合成巴氯芬。  相似文献
5.
由于二芳香基甲酮的位阻大及羰基两侧的取代基差异性较小,对其进行不对称还原是生物催化中具有挑战性的难题之一.文中通过对毕赤酵母GSl15基因组序列的分析,发现了一个潜在羰基还原酶基因pascr.将该基因克隆、表达在大肠杆菌Rosetta2 (DE3)中,通过Ni-NTA对重组蛋白进行了分离纯化,并对酶的性质进行了研究.PasCR专一性利用NADPH作为辅酶,其最适反应pH为6.5;最适反应温度为35℃;凝胶层析实验结合SDS-PAGE分析表明PasCR在溶液中以二聚体形式存在.PasCR能够不对称还原位阻较大的二芳香基甲酮类化合物,如4-甲基二苯甲酮、4-氯二苯甲酮、2-氯二苯甲酮等,对4-甲基二苯甲酮的还原产物的ee值达到了85%.  相似文献
6.
研究了利用生物催化剂制备(S)-4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸.以3-(4-氯苯基)-戊二腈为底物,采用苯酚-次氯酸钠法对实验室保藏的菌株进行筛选,得到一株产物立体选择性较高的菌株赤霉菌Gibberella intermedia WX12,并对其催化特性和发酵条件进行了初步研究.以30 g/L的乳糖和20 g/L的蛋白胨分别为碳、氮源,发酵培养96 h,收集的菌体在50 mmol/L磷酸缓冲液(pH 8.0)中30℃催化反应24 h,将3-(4-氯苯基)-戊二腈转化为4-氰基-3-(4-氯苯基)-丁酸,产率为90%.将产物化学转化为巴氯芬,手性HPLC分析表明水解产物构型是(S),其对映异构体过量值ee> 99%.该产物可以用来合成光学纯的(R)-和(S)-巴氯芬.  相似文献
7.
ω-转氨酶 (ω-transaminase) 可以通过手性拆分和不对称合成的催化反应来获得光学纯的手性胺类化合物和非天然氨基酸,在医药中间体合成中是一种重要的生物催化剂。采用基因挖掘技术,在基因组数据库中获得一个来自伯克氏菌Burkholderia phytofirmans PsJN的ω-转氨酶基因 (hbp),将该基因在大肠杆菌BL21 (DE3) 中克隆、表达,利用镍柱亲和层析将该酶 (HBP) 进行纯化并研究了其酶学性质和底物谱。结果表明,以β-苯丙氨酸 (β-Phe) 为氨基供体、丙酮酸为氨基受体,HBP具有较高的活力 (32.47 U/mg) 和立体选择性;其最适温度为40 ℃左右,最适pH在8.0–8.5之间。研究过程中,建立了一种简便快捷的紫外吸收法来检测β-Phe的脱氨反应,证明了该反应的热力学平衡性质。底物谱研究表明HBP可以以β-Phe及其衍生物为氨基供体。结果表明HBP能够有效地手性拆分rac-β-Phe及其衍生物,转化率在50%左右,ee>99%。  相似文献
8.
根据羰基还原酶催化可逆氧化还原反应的原理,利用与偶氮还原酶催化偶氮染料还原反应耦合的颜色变化,建立了一种新的羰基还原酶筛选方法。由于羰基还原酶在催化醇底物氧化反应时会产生NAD(P)H,当在反应体系中加入偶氮还原酶AzoB和偶氮染料金橙Ⅰ的时候,偶氮还原酶可以利用NAD(P)H作为电子的供体与底物金橙Ⅰ发生反应,导致反应体系颜色的变化,这样就能够根据明显的颜色变化推断出该羰基还原酶是否对所选底物表现出特定的活性,进而可以筛选出有活性的羰基还原酶。同时,使用不同构型的手性醇作为底物时,根据体系的颜色变化,可以实现羰基还原酶的活性和立体选择性的同时筛选。  相似文献
9.
卤醇脱卤酶 (Halohydrin dehalogenase) 不仅对于含氯污染物的生物降解、净化环境具有重要意义,而且在手性医药中间体合成中也是一种重要的生物催化剂,但其数量较少。采用基因挖掘在基因组数据库中获得一种来自运动替斯崔纳菌Tistrella mobilis KA081020-065的新型卤醇脱卤酶基因HheTM,将该基因克隆、表达在大肠杆菌BL21(DE3)中,利用镍柱亲和层析将该酶进行纯化并研究了其酶学性质。HheTM是一种同源四聚体;最适温度为50 ℃;不同的 pH 缓冲液对其活性有较大影响;在碱性、30 ℃以下的条件下稳定性高。在氰根离子存在的条件下,HheTM能够催化(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯合成(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯,为酶法合成阿托伐他汀关键中间体提供了一种新的卤醇脱卤酶。  相似文献
10.
辅酶NAD(H) 相比NADP(H) 有稳定性好、价格低廉及更广的辅酶循环方法等优势,因此在实际应用中常需将NADP(H) 赖型的脱氢酶改造成为NAD(H) 依赖型的。来源于嗜热共生杆菌Symbiobacterium thermophilum的NADP(H) 依赖型内消旋-2,6-二氨基庚二酸脱氢酶 (meso-2,6-diaminopimelate dehydrogenase, StDAPDH) 及其突变体酶是催化还原氨化合成D-氨基酸的优良催化剂,本研究试图改变其辅酶偏好性,增强其应用优势。对其晶体结构分析可知,氨基酸残基Y76距离腺嘌呤较近,R35及R36和辅酶上磷酸基团有直接相互作用。依氨基酸侧链基团性质对Y76进行了定点突变,发现不同突变子对两种辅酶的偏好性都发生了变化;对与磷酸基团直接作用的R35、R36进行的双突变R35S/R36V,导致酶对NADP+的催化活力降低;将R35S/R36V和部分Y76突变进行了组合,发现三突变组合以NAD+为辅酶时的活力均大于以NADP+为辅酶的活力,实现了辅酶偏好性转变。这些研究工作为进一步实现StDAPDH的辅酶偏好性完全转变提供依据。  相似文献
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