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1.
抗禽流感病毒多表位DNA疫苗的构建及其免疫效力研究   总被引:18,自引:1,他引:17       下载免费PDF全文
多表位DNA疫苗是建立在常规DNA疫苗基础上的一种新型疫苗。它是用表位作免疫原,这样就比较容易在一个表达载体上克隆病原体的多个抗原基因中具有免疫活性的部分。本试验以H5N1亚型禽流感病毒的HA和NP基因及其表位为基础构建了4个重组质粒:1 pIRES/HA(表达全长的HA基因);2 pIRES/tHA(只表达HA基因的主要抗原表位区);3 pIRES/tHANpep(融合表达HA基因的抗原表位区和NP基因的3个CTL表位);4 pIRES/tHANpep-IFN-γ(用鸡的IFN-γ基因取代质粒pIRES/tHANpep中的neo基因)。分别用这4个重组质粒和空载体质粒pIRES1neo肌注免疫30日龄SPF鸡。免疫3次,间隔为2周,每次每只鸡的剂量为200μg。第3次免疫后两周以高致病性禽流感病毒H5N1强毒攻击,免疫及攻毒前后均采血检测HI抗体效价和外周血CD4+、CD8+T细胞的变化。结果发现,攻毒前各质粒免疫组均检测不到HI抗体,攻毒后1周存活鸡HI抗体效价迅速升高到64~256。流式细胞仪检测显示外周血CD4+、CD8+T细胞在疫苗免疫后都有不同程度的升高。空载体质粒对照组鸡(10只)在攻毒后3~8 d内全部死亡,其他各重组质粒免疫组鸡都获得了部分保护,保护率分别是:pIRES/HA组为545%(6/11),pIRES/tHA组为30%(3/10),pIRES/tHANPep组为36.3%(4/11), pIRES/tHANPepIFNγ组为50%(5/10)。这些结果表明我们构建的多表位DNA疫苗能够诱导机体产生特异性免疫应答,并在同型禽流感强毒攻击时对鸡只提供了一定的保护。  相似文献
2.
猪瘟病毒强毒株和兔化弱毒疫苗株E2糖蛋白分别含有5个和6个潜在的糖基化位点,其中986N是兔化弱毒疫苗株所特有的。为了分析二者糖基化位点差异及其影响,将去掉信号肽和跨膜区的猪瘟病毒石门强毒株(Shi-men)和兔化弱毒疫苗株(HCLV)E2基因置于蜂素信号肽序列下游,使其在Sf9细胞内表达重组Shimen-E2和HCLV-E2蛋白。结果显示,重组E2蛋白以二聚体的形式分泌表达于细胞培养液中,但二者分子量存在差异。用endo H和PNGase F对纯化后的重组E2蛋白进行去糖基化处理后,二者分子量大小变成一致,证实石门强毒株和兔化弱毒株E2蛋白分子量大小的差异可能是由于糖基化程度的差异所致。对986N糖基化位点进行定点突变后发现,突变后的Shimen-E2与野生型HCLV-E2分子量大小一致,而突变后的HCLV-E2与野生型Shimen-E2分子量大小一致,表明Shimen-E2和HCLV-E2分子量大小的差异的确是由于986N糖基化位点的差异引起的。  相似文献
3.
将猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus,PRRSV)CH-1a株GP5基因插入到伪狂犬病病毒(Pseudorabies Virus,PRV)Bartha-K61株TK基因中,获得了一株TK^-/gE^-表型的重组伪狂犬病病毒,命名为rPRV—GP5。经生长动力学、表达动力学和间接免疫荧光证实PRRSV GP5在重组病毒中获得了表达,表达蛋白的抗原性与亲本病毒相似,rPRV-GP5在不同的细胞上毒价和细胞病变与Bartha—K61比较无显著差异。4只PRV抗体阴性的绵羊,每只接种10^6.0。PFU的rPRV-GP5可以完全抵抗10^3LD50伪狂犬病强毒S株的攻击。10头PRV、PRRSV抗体阴性的仔猪滴鼻接种rPRV-GP5 10^7.0 PFU/头并在接种后63d攻击PRRSV CH-1a株10^5.0 TCID50/头,攻毒后3d和5d出现了PRRSV荧光抗体和ELISA抗体,在政毒后14d检测到了PRRSV中和抗体,Bartha—K61活疫苗组和对照组至实验结束时仍未检测到PRRSV中和抗体。这说明rPRV-GP5免疫产生了针对PRRSV的回忆性免疫应答。  相似文献
4.
将猪瘟病毒E2基因克隆于我们此前构建的衍生于Semliki Forest病毒(semliki forest virus,SFV)RNA复制子的新型真核表达载体pSFV1CS中,获得重组质粒pSFV1CS-E2。用纯化的pSFV1CS-E2分别转染BHK-21细胞和293T细胞,经间接免疫荧光试验检测显示,CSFV E2基因在转染细胞中得到表达。小鼠接种试验结果表明,10μg或100μg pSFV1CS-E2可诱导小鼠产生猪瘟特异性抗体。  相似文献
5.
几种表达系统的比较   总被引:7,自引:0,他引:7  
随着蛋白质工程和DNA重组技术的发展,许多有应用潜力的蛋白分子有待开发。不同蛋白在不同系统中表达水平有显著差异,所以选择一种合适的表达系统对蛋白表达水平非常关键。对细菌,酵母,昆虫杆状病毒,哺乳4种表达体系作一概述,并讨论各自优缺点及常见问题。  相似文献
6.
为了构建猪瘟重组腺病毒载体疫苗,通过细菌内同源重组法构建了含有猪瘟病毒E2基因的重组腺病毒rAdV-E2.测定其一步生长曲线,同时用间接免疫荧光试验和Western blotting检测外源基因表达,然后用rAdV-E2免疫家兔,免疫后6周用猪瘟兔化弱毒疫苗株(c株)进行攻击,攻毒后3 d取其脾脏,用实时荧光定量RT-PCR检测C株病毒RNA.结果表明,该重组腺病毒传至第10代时,毒价可达1.0×1010TCID<,50/mL;外源基因可在其中得到稳定表达;rAdV-E2接种兔免疫后2周产生猪瘟特异性抗体,免疫后5 W抗体达到峰值,攻毒后rAdV-E2接种兔和C株接种兔均未出现定型热反应,从其脾脏也未检测到C株病毒RNA,而野生型腺病毒接种兔均出现了定型热反应,并且从其脾脏检测大量C株病毒RNA,其含量达到了103拷贝/μL以上.由此表明,rAdV-E2可望开发为猪瘟候选疫苗.  相似文献
7.
马传染性贫血强/弱毒嵌合病毒的体外构建   总被引:4,自引:0,他引:4  
马传染性贫血病毒(equine infectious anemia virus,EIAV)引起马传染性贫血(简称马传贫),导致马持续性感染和反复病毒血症[1].EIAV与人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)同属反转录病毒科慢病毒属,二者有很多相似的特性[2].在反转录病毒前病毒基因组两端含有长末端重复序列(long terminal repeat,LTR).LTR含有真核启动子,其中含有病毒转录调控顺式作用位点,病毒编码的反式作用因子与其结合后可以反式激活基因的表达,对病毒基因的表达和其它生命活动起重要调控作用[3,4].因此,LTR序列的变异可能会引起病毒转录和复制方式的改变,进而引起其细胞嗜性和致病性的改变[5,6].为了探讨LTR在EIAV病毒复制和转录过程中的作用,并进一步研究EIAV的致病和免疫机制,用EIAV强毒L株LTR置换了以前构建的EIAV DLA(弱毒)感染性分子克隆中的LTR,构建了马传贫强/弱毒嵌合分子克隆,并获得了具有感染性的强/弱毒嵌合病毒.  相似文献
8.
RNA复制子疫苗   总被引:4,自引:1,他引:3       下载免费PDF全文
RNA复制子是自主复制的RNA,保留了病毒复制酶基因,而结构蛋白基因缺失,由外源抗原基因取代,复制酶可控制载体RNA在胞浆中高水平复制和外源基因的高水平表达。用于开发复制子的主要是单股正链RNA病毒,如甲病毒(辛德比斯病毒、塞姆利基森林病毒、委内瑞拉马脑炎病毒)、黄病毒(登革热病毒、昆津病毒)、小RNA病毒(脊髓灰质炎病毒、人鼻病毒)、副粘病毒(犬瘟热病毒)、杯状病毒(猫杯状病毒)。基于复制子的疫苗不会产生能复制的感染性病毒粒子,不可能与细胞基因组发生整合,但可诱导全身免疫和粘膜免疫以及MHCI限制性CTL反应,而不受体内已有载体抗体的干扰。目前已开发了大量基于复制子的疫苗和肿瘤的治疗性和预防性疫苗,并在很多疾病模型上取得成功,包括病毒(流感病毒、人免疫缺陷病毒、拉沙病毒、马尔堡病毒、呼吸道合胞体病毒、诺沃克样病毒、马动脉炎病毒等)肿瘤(人乳头瘤、癌胚抗原、B16肿瘤、小鼠黑素瘤等)、以及细菌毒素(肉毒杆菌毒素、葡萄球菌肠毒素、破伤风毒素等)。  相似文献
9.
根据伪狂犬病病毒(PRV)Min-A株gE基因序列,利用PCR方法扩增了PRV-gE基因不含信号肽、胞内区和跨膜区的主要抗原表位区,并克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,获得的重组质粒命名为pGEX-tgE。经SDSPAGE电泳分析证实克隆的部分gE基因获得了表达,融合表达产物大小约为63kD,并在终浓度为0.6mmol/L的IPTG诱导下,3.5h其表达量达到高峰。通过改变诱导条件,有效抑制了包涵体形成,提高了重组蛋白的溶解性。Western blot分析证实表达的重组gE蛋白具有抗原反应活性。将表达产物利用亲和层析法纯化后作为ELISA抗原,通过对其特异性、敏感性及工作条件的优化试验,和对48份PRV阴性血清样品的检测结果的统计学分析,建立了猪伪狂犬病tgE-ELISA鉴别诊断方法。通过对400份送检血清样品的检测结果分析,表明其与PRV全病毒ELISA试验的符合率高达95%以上,与基于抗gE蛋白单抗竞争性ELISA的符合率达94%。此方法可用于gE基因缺失PRV疫苗免疫动物和PRV自然感染动物的鉴别诊断。  相似文献
10.
猪瘟DNA疫苗研究进展   总被引:4,自引:0,他引:4       下载免费PDF全文
自1990年DNA疫苗问世以来,已有许多研究者构建了不同类型的DNA疫苗。这些载体能诱发机体产生不同程度的特异性体液免疫和(或)细胞免疫。研究者们也在猪瘟DNA疫苗研究方面做出了很多努力并取得了一定的成果。以下从猪瘟DNA疫苗的构建和评价、佐剂在猪瘟DNA疫苗中的应用、猪瘟DNA疫苗与其他疫苗的联合应用以及目前猪瘟DNA疫苗存在的问题和解决途径等方面做了比较全面的阐述。  相似文献
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