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【目的】建立藤黄生孢链霉菌NRRL 2401的遗传操作系统和基因文库,以便筛选次级代谢产物生物合成基因。【方法】利用大肠杆菌和链霉菌的属间接合转移的方法,以整合型载体pPM927、pSET152和复制型载体pJTU1278构建链霉菌遗传操作系统。以pCClFOS^(TM)载体,大肠杆菌EP1300^(TM)-T1~R为宿主菌构建Fosmid文库。随后,设计引物,利用"板池-行池-单克隆"的三级PCR方法对文库进行快速筛选。【结果】pPM927、pSET152和pJTU1278均成功转入藤黄生孢链霉菌NRRL 2401,其中pSET152载体的转化效率最高。构建了稳定高效的藤黄生孢链霉菌NRRL 2401的基因文库,含2880个克隆,平均插入片段大小约为35 kb,空载率小于1%,文库覆盖率为99.99%,覆盖基因组16.5倍。同时,初步筛选出可能含有吲哚霉素生物合成基因簇的9个阳性克隆。【结论】成功构建了稳定高效的藤黄生孢链霉菌NRRL 2401遗传操作系统和高质量的基因文库,为克隆该菌中次级代谢产物生物合成基因簇以及进一步遗传改造奠定了基础。 相似文献
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【目的】钙霉素是二价阳离子载体,是一类含有吡咯环的聚醚类抗生素,广泛用于细胞二价阳离子的生物学功能研究。本文以钙霉素生物合成基因簇中cal D基因为研究对象,通过蛋白质同源序列比对、基因敲除、回补验证及HPLC/MS分析,对cal D基因的功能进行表征。【方法】对cal D基因功能进行生物信息学预测。选用钙霉素产生菌Streptomyces chartreusis NRRL 3882,通过PCR-targeting的方法对cal D基因进行敲除获得突变株,再将cal D基因克隆到链霉菌整合质粒上,通过接合转移技术将cal D回补到缺失株中。使用HPLC/MS技术对菌株发酵产物进行分析。【结果】生物信息学预测Cal D蛋白酶属于氧化还原酶。获得cal D基因敲除突变株Δcal D及基因回补菌株Δcal D:cal D。HPLC/MS检测到cal D基因的缺失菌株大幅降低钙霉素产生能力,与野生型菌株相比,突变株中积累更多的3-Hydroxylcezomycin和更少的氮-去甲基钙霉素。【结论】cal D参与钙霉素的生物合成。cal D的缺失导致3-Hydroxylcezomycin的积累,推测cal D负责钙霉素生物合成途径中苯并噁唑环3位上羟基转化成酮基的氧化反应。初步阐明了cal D基因在钙霉素生物合成途径中的功能机制。 相似文献
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HAU3是寄主范围很广的放线菌噬菌体。Southern杂交实验表明,HAU3可以整合到吸水链霉菌应城变种10-22和变铅青链霉菌66的突变体ZX1的染色体中,形成溶原,其溶原菌自发释放HAU3,不受热激和紫外线照射的诱导。通过比较HAU3衍生噬粒pIJ8300的DNA酶切片段在加热前、后电泳带谱的区别,将HAU3的cos位点在pIJ8300的图谱上得到了定位。还利用Southern杂交的方法定位了HAU3与宿主形成溶原时附着位点(attP),并利用脉冲电泳技术定位了在变铅青链霉菌ZX7和吸水链霉菌应城变种10-22中形成溶原的附着位点(attB)。这些信息均有利于以HAU3为基础的载体的发展和优化。 相似文献
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bldA编码天蓝色链霉菌中唯一有效识别UUA亮氨酸密码的tRNA(Leu)UUA。通过构建阿维链霉菌NRRL8165基因组亚文库,筛选得到含有阿维链霉菌bldA。及其侧翼序列的克隆。利用λRED介导的PCR targeting技术构建了bldA。的基因置换质粒pHL358,将其跨属接合转移进入阿维链霉菌NRRL8165,筛选得到bldA。基因置换菌株TW10。TW10表现为光秃表型,表明bldA。调控阿维链霉菌的形态分化。摇瓶发酵TW10菌株并对发酵产物进行HPLC分析,发现TW10菌株均不合成阿维菌素组分,提示阿维菌素的合成受bldA。调控;考察阿维菌素生物合成基因簇,其中areA3和aveR含有TTA密码,它们的翻译可能受bldA。调控,与实验结果一致。 相似文献
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【背景】作为临床最常见的非结核条件致病分枝杆菌,脓肿分枝杆菌(Mycobacteroides abscessus)因其天然、多耐药等特性成为目前临床治疗的一大挑战。作为分枝杆菌限制性营养元素——铁摄取的关键系统,分枝杆菌素(mycobactin,MBT)、羧基分枝杆菌素(carboxymycobactin,cMBT)与病原分枝杆菌的毒力、耐药等密切相关。【目的】丰富分枝杆菌MBT、cMBT结构数据,探究MBT在致病分枝杆菌起源过程中的演化规律。【方法】在MALDI-TOF-MS与FT-MS/MS解析脓肿MBT、cMBT结构的基础上,进一步开展其活性分析与生物合成基因簇比较基因组分析。【结果】虽然脓肿分枝杆菌MBT、cMBT母核修饰模式与海洋分枝杆菌最相似,R1、R2、R3、R5等位置的修饰完全相同,而且脂肪酸链均位于R4位置;但脂肪酸链长度不同[C10-17 (MBT)、C4-8 (cMBT)],为新结构。Fe-cMBT不仅以浓度依赖方式促进脓肿分枝杆菌生长,而且利用效率显著高于FeCl3,相关结果表明MBT-cMBT是脓肿分枝杆菌高效获取铁元素的关键系统。与MBT结构结果一致,mbt-1基因簇共线性分析及mbt-1、mbt-2系统发育分析结果均表明脓肿分枝杆菌与海洋分枝杆菌(M.marinum)亲缘关系最近,而非结核分枝杆菌(M.tuberculosis)或耻垢分枝杆菌(M.smegmatis) (基于16S rRNA基因序列分析)。进一步分析发现,M.marinum、M.tuberculosis、M.bovis等病原分枝杆菌脂肪酸链长度变化范围仅4 C,而M.abscessus、M.fortuitum、M.avium和M.smegmatis等条件致病与非致病菌的脂肪酸链长度变化范围为7-11 C,暗示MBT同系物脂肪酸链长度变化范围与分枝杆菌不同生活方式、环境之间可能存在关联。【结论】作为获取铁元素的关键系统,具有独特结构的脓肿分枝杆菌MBT-cMBT在致病、耐药等方面的作用及起源、演化规律值得深入研究。 相似文献
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天然产物及其衍生物在现代医疗中扮演着举足轻重的角色,其生物活性多样性以及化学结构的丰富性是新药研发的源泉和动力。利用纯化学方法合成天然产物在技术和成本上有很大的困难,加上许多天然产物的原始产生菌具有培养条件苛刻、产量低下等缺点,而且大量基因簇在原始菌株中是沉默的,这使得利用合成生物学思想来指导天然产物生物合成基因簇的异源表达具有重大意义。作为抗生素、抗肿瘤活性物质、免疫抑制剂等次级代谢产物主要来源的放线菌一直是研究者们关注的焦点,特别是随着基因测序技术的飞速发展,人们发现链霉菌基因组中包含着极为丰富的天然产物生物合成基因簇资源。这意味着开发链霉菌底盘细胞作为异源表达宿主有其得天独厚的优势。本综述从底盘细胞开发的意义入手,重点阐述链霉菌底盘细胞构建的策略及现状,随后通过实例阐述了各种底盘链霉菌的实际应用。 相似文献
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【目的】为探究含具有抗肿瘤活性的美登素的滑桃(Trewia nudiflora)种子中内生放线菌的多样性,以及从内生放线菌中寻找萘醌类化合物产生菌。【方法】利用放线菌富集筛选培养基对经消毒处理的滑桃种子进行内生菌分离,根据菌落形态及16S rRNA基因序列分析进行菌种的分类鉴定。通过对所分离到的内生放线菌拮抗模式病原细菌(金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌)、作物病原真菌(小麦赤霉菌、水稻纹枯病致病菌等)活性检测,以及萘醌类化合物合成关键基因为探针定向筛选萘醌类化合物产生菌。【结果】从分离到的100余株滑桃种子内生菌中鉴定出66株以链霉菌为主的放线菌,发现Streptomyces sp.HTZ27菌株含有目标基因,经固体发酵、化合物分离纯化、鉴定后,发现该菌发酵产物中有呋喃萘醌I,得率接近5 mg/L。【意义】本研究采用的化学遗传学方法可有效提高筛选目标化合物产生菌的效率,所筛选到FNQ I产生菌为深入研究呋喃萘醌类化合物生物合成与调控、抗肿瘤分子机理以及产业化应用等创建了有利条件。 相似文献
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【背景】大量文献报道ω-3多不饱和脂肪酸尤其是二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid,DHA)与二十碳五烯酸(Eicosapentaenoic Acid,EPA)具有抗肿瘤作用,但是其抗肿瘤机制还不够完善。【目的】探究ω-3多不饱和脂肪酸、具核梭杆菌以及结直肠癌三者之间的关联。【方法】在检测二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸、α-亚麻酸(α-Linolenic Acid,ALA)等ω-3多不饱和脂肪酸对人结直肠腺癌细胞Caco-2、正常结肠上皮细胞NCM460生长影响的基础上,检测DHA等3种多不饱和脂肪酸对具核梭杆菌黏附人体细胞以及Fap2、FadA、RadD等具核梭杆菌毒力关键基因表达的影响。【结果】30μg/mL的DHA、EPA、ALA对Caco-2生长抑制分别为9.09%、4.95%、7.52%,而对NCM460生长抑制达31.15%、25.48%、29.11%,而且相关抑制作用仅具有浓度依赖性而无时间依赖性。经30μg/mL的DHA、EPA、ALA预处理的具核梭杆菌黏附Caco-2细胞的能力分别下降81.04%(P=0)、93.63%(P=0)和68.63%(P=0);而共培养时加入DHA、EPA、ALA对具核梭杆菌黏附Caco-2细胞的能力没有显著影响。同时,30μg/mLDHA处理导致F.nucleatum的Fap2基因显著下降10.22%(P=0.027);30μg/mL EPA处理导致FadA、Fap2基因分别显著下降23.49%(P=0)、15.09%(P=0.003);30μg/mL ALA处理导致FadA基因显著下降26.75%(P=0.012)。【结论】综合上述实验结果以及DHA、EPA、ALA仅能短时间抑制具核梭杆菌生长等文献报道,我们认为,DHA、EPA等ω-3多不饱和脂肪酸并非简单地直接杀伤或抑制肿瘤细胞和F.nucleatum;抑制FadA、Fap2等黏附相关基因表达,降低F.nucleatum黏附宿主细胞能力是其抗肿瘤作用的关键组成部分。ω-3多不饱和脂肪酸等活性物质对F.nucleatum等在结直肠肿瘤发生、发展中发挥重要作用的肠道细菌的影响与机制应深入开展研究。 相似文献