人源CDC50基因的分子克隆及在E.coli中的表达

糖皮质激素受体 (GR)为一种特异性配体诱导的转录因子在机体发育、生理及行为等过程中发挥重要作用 .这一过程往往受到转录协同调节因子的控制 ,包括协同抑制因子或协同激活因子的作用 .克隆了人源双跨膜受体分子 ,并命名为hCDC5 0 .该分子编码区有 10 5 6bp ,与鼠源基因mCDC5 0在核苷酸水平有 90 %一致性 .将hCDC5 0蛋白的 16 4～ 317编码序列与GST融合构建原核表达质粒进行重组蛋白的表达与纯化并制备多抗 .用二维双向扩散检测抗体为阳性 ,抗原的滴度为12 5 μg/ml.体外翻译研究显示该基因编码蛋白约为 4 0kD ,与Western检测在动物细胞中的表达一致 .用hCDC5 0真核表达质粒与GR萤光报告系统共转染COS 7细胞显示 ,hCDC5 0对GR信号转导有明显的抑制作用 ,其对GR信号通路的抑制作用达 3～ 4倍以上 .hCDC5 0可能为一个新的协同抑制因子 ,在抑制GR的转录激活过程中起作用     

人源CDC50基因的分子克隆及在E.coli中的表达

糖皮质激素受体 (GR)为一种特异性配体诱导的转录因子在机体发育、生理及行为等过程中发挥重要作用 .这一过程往往受到转录协同调节因子的控制 ,包括协同抑制因子或协同激活因子的作用 .克隆了人源双跨膜受体分子 ,并命名为hCDC5 0 .该分子编码区有 10 5 6bp ,与鼠源基因mCDC5 0在核苷酸水平有 90 %一致性 .将hCDC5 0蛋白的 16 4～ 317编码序列与GST融合构建原核表达质粒进行重组蛋白的表达与纯化并制备多抗 .用二维双向扩散检测抗体为阳性 ,抗原的滴度为12 5 μg/ml.体外翻译研究显示该基因编码蛋白约为 4 0kD ,与Western检测在动物细胞中的表达一致 .用hCDC5 0真核表达质粒与GR萤光报告系统共转染COS 7细胞显示 ,hCDC5 0对GR信号转导有明显的抑制作用 ,其对GR信号通路的抑制作用达 3～ 4倍以上 .hCDC5 0可能为一个新的协同抑制因子 ,在抑制GR的转录激活过程中起作用     

基因芯片分析技术(二)

(续 2 0 0 0年第 7期第 7页 )3　基因芯片的使用基因芯片块制作好后 ,关键就是用它来完成特殊的实验。其基本原理就是将研究的细胞或组织 RNA加以标记 ,与基因芯片块上所点印的基因片段进行杂交 ,从而探测特定基因的表达。3 .1　准备探针　与传统的 Northern Blot正好相反 ,这里我们将所有表达的 RNA作为探针来源。所以探针的准备工作要包括 RNA的提取和标记。3 .1 .1　 RNA的提取　提取 RNA的方法很多。现在市场上有很多提取 RNA的试剂盒 ,用起来十分方便。不管用什么方法 ,提取 RNA的质量和产量是问题的关键。对于研究基因表达…     

草坪草狗牙根中抗逆基因BeDREB的克隆及功能鉴定

DREB(dehydrationresponsiveelementbindingprotein)蛋白是一类在植物中所特有的,能与DRE(dehydrationresponsiveelement)顺式作用元件特异性结合的转录因子,调控与干旱、高盐以及低温等逆境胁迫应答有关基因的表达.根据狗牙根近缘植物的DREB转录因子的AP2EREBP保守结构域的基因序列,通过RTPCR和RACE的方法分别从冷诱导和盐诱导的狗牙根cDNA中扩增到了2个似DREB基因,分别命名为BeDREB1和BeDREB2,并已提交NCBIGenBank,其登录号分别为AY462117和AY462118.这两个基因的编码框均为753个碱基,编码251个氨基酸,具有DREB转录因子的典型特征.两种逆境胁迫下扩增的基因序列同源性很高,达到了97.8%.利用酵母单杂交真核转录激活的方法进行了功能鉴定,证明BeDREB1和BeDREB2蛋白均可以与DRE顺式作用元件结合,激活下游报告基因HIS3的表达.RTPCR结果显示,BeDREB1基因受冷胁迫诱导表达,而BeDREB2受盐胁迫的诱导表达,且随着诱导时间的不同,表达量也在发生变化.上述结果表明,从狗牙根中克隆到的BeDREB1和BeDREB2基因属于DREB转录因子家族的新成员,在狗牙根中分别与冷胁迫和盐胁迫的信号转导有关.     

蛋白酪氨酸激酶NOK／STYK1胞内区的表达与纯化

目的：酪氨酸蛋白激酶NOK／STYKl具有很强的促肿瘤形成和转移能力,被认为是很有前途的肿瘤治疗靶点。由于NOK含有一个跨膜区,且富含疏水性氨基酸,其表达和纯化非常困难,直接影响了对其功能及相关分子机理的深入研究。本研究目的是获得可溶的且纯度较高的NOK胞内区融合蛋白ANOK（AA：49—422）,为后续抗体的制备和功能研究奠定重要基础。方法：含有△NOK基因的原核表达载体,转入E-coliBL21中,IPTG诱导蛋白表达,通过亲和层析获得可溶的△NOK融合蛋白。融合蛋白经凝血酶酶切后,凝胶过滤层析分离标签蛋白获得z~NOK蛋白。同时,我们还通过Bac-to-Bac系统获得含有ANOK基因的杆状病毒,感染sO细胞,尝试在真核细胞中表达目的蛋白。结果：通过在sf9昆虫细胞和大肠杆菌表达系统中盐浓度等各种条件的摸索,首次获得了可溶的且纯度较高的NOK胞内区融合蛋白（ANOK—GST）和一定量去除标签的ANOK蛋白。本研究中与大肠杆菌相比,昆虫细胞并不适合△NOK的纯化。结论：我们建立了一套优化的NOK蛋白表达和纯化体系,从而为后续抗体制备和各种体内外生化实验等功能研究奠定基础,为研究NOK在肿瘤中的作用和药物筛选创造条件。同时丰富了整个RTKs家族作用机制的探索,进一步促进了以RTKs为靶点的治疗手段在临床上的应用。     

城市规模对大气污染物NO2和PM2.5浓度的影响

随着我国城市的快速发展,城市的区域性大气污染问题日益突出,尤其是大城市和超大城市的污染问题更加严重。那么城市规模的扩大是否必然导致空气污染的加剧?控制城市人口规模是否是防治空气污染的有效手段?这些问题成为空气污染防治中政府、公众和学者广泛关注的焦点。采用2013年冬季全国114个重点城市两种典型大气污染物-NO_2(传统)和PM_(2.5)(新型)-浓度的实时监测数据,首先分析了这两种大气污染物的空间分布特征,进而定量分析城市人口规模和大气污染物浓度的关系。结果显示:(1)仅有21%的城市NO_2浓度达到WHO的城市年均浓度标准(40μg/m~3),全部城市的PM_(2.5)浓度高于WHO年均浓度标准(10μg/m~3);(2)大气污染物的空间分布具有显著的集聚特征和区域性特征,表现为:NO_2呈较为分散的空间分布,而PM_(2.5)的空间分布呈现"北高南低、内陆高沿海低"的特征。NO_2浓度高的区域主要分布在天津、河北东南部和山东中部地区,PM_(2.5)浓度高的区域主要分布于河北西南部和山东西部;(3)常住人口规模同冬季NO_2和PM_(2.5)浓度呈倒"U"型关系;在1000到1200万的城市冬季平均NO_2和PM_(2.5)浓度最高(NO_2:69.28μg/m~3,PM_(2.5):119.58μg/m~3)。(4)总人口低于1200万的城市,冬季NO_2浓度和PM_(2.5)浓度随着城市规模增加而显著升高(NO_2:r=0.44,P0.01;PM_(2.5):r=0.43,P0.01);总人口高于1200万的城市,NO_2浓度同城市规模呈显著负相关关系(r=0.91,P0.05),PM_(2.5)浓度随城市规模增加逐渐降低。(5)常住人口密度在1000人/km~2以下的重点城市,NO_2和PM_(2.5)浓度同城市人口密度呈显著正相关关系(NO_2:r=0.23,P0.05;PM_(2.5):r=0.36,P0.01)。常住人口密度在1000人/km~2以上的城市人口密度同NO_2和PM_(2.5)浓度呈显著负相关关系(NO_2:r=-0.61,P0.05;PM_(2.5):r=0.63,P0.01)。以上研究结果可以为划定不同大气污染物的重点防治区域和制定联合防治行动计划提供理论依据,并为重点城市大气污染治理和城市人口规模控制理论完善提供参考。     

冬季PM2.5的气象影响因素解析

气象因素能够显著影响PM_(2.5)浓度,可减轻或加剧城市空气污染,尤其是在雾霾严重的冬季。同时由于城市间污染物排放强度和扩散条件的差异,雾霾的发生往往具有较强的区域性。选择了石家庄、西安、北京、太原、广州5个不同污染区域的典型城市,首先分析多个气象因子与PM_(2.5)浓度的关系,进而研究气象因素对PM_(2.5)浓度变异解释度的差异,以及气象因子对PM_(2.5)浓度影响的相对重要性,进一步对比分析气象因素对PM_(2.5)浓度影响在不同污染程度的城市之间的差异,解析了不同城市的主要气象影响因素和气象因素的综合影响程度。研究结果表明:(1)气象条件与PM_(2.5)日浓度显著相关,且在不同污染程度的城市与PM_(2.5)浓度相关的气象因子不同。与石家庄冬季PM_(2.5)浓度相关的气象因素为相对湿度、平均风速;与西安PM_(2.5)浓度相关的主要气象因素为相对湿度、平均风速和最大持续风速;与北京PM_(2.5)浓度相关的主要气象因素相对湿度、日均温度、平均风速、最大持续风速和最低温;与太原PM_(2.5)浓度相关的主要气象因素为日均温、相对湿度、平均风速、最高温、最低温和最大持续风速;与广州PM_(2.5)浓度相关的主要气象因素为相对湿度、平均风速、最高温和降雨量。(2)PM_(2.5)浓度越高的地区,气象因素能够解释的PM_(2.5)浓度变异越小。严重污染区的石家庄气象因素多元回归分析的R~2为0.27,重污染区的西安气象因素多元回归分析R~2为0.29,中污染区的北京气象因素多元回归分析R~2为0.46,污染地区的太原气象因素多元回归分析R~2为0.67。研究结果揭示了不同城市的主要气象影响因素及其综合影响程度,可为城市PM_(2.5)控制和预测精度提高提供理论参考,并为区域生态环境规划和城市协调发展提供科学依据。     

基因芯片分析技术(一)

基因芯片技术是近年发展真情为的一项新技术。文中较详细地阐述了基因芯片的要领种类、操作过程和应用。     

晶状体上皮源性生长因子对MGARP基因的调控作用研究

目的:研究HEK-293T细胞中晶状体上皮源性生长因子(lens epithelium-derived growth factor,LEDGF)对富含酸性氨基酸的线粒体定位蛋白(Mitochondria-localized Glutamic Acid Rich Protein,MGARP)基因表达的调控作用。方法:将不同剂量的含有LEDGF基因的载体,转入HEK-293T细胞中,通过Western blot和启动子报告分析检测的方法,检测细胞内MGARP的表达水平。并采用LEDGF和Sp1共同转染的方法,来检测二者对MGARP转录活性的协同调控作用。结果:与空载体对照组相比,随着含有LEDGF基因载体剂量的增加,HEK-293T细胞内MGARP的表达也明显上调(P0.05),同时共同转染LEDGF和Sp1后,细胞内MGARP的转录活性比单独过量表达LEDGF或者Sp1的转录活性明显增高(P0.05)。结论:在HEK-293T细胞中,LEDGF可以调控MGARP的表达,而且,LEDGF和Sp1对MGARP的调控具有协同作用。     

3D打印的医用材料在组织修复与治疗中的应用

当前由于交通和运动事故频发、骨肿瘤等疾病导致骨缺损、皮肤创伤不断加重等情况使病例日益增多，临床对修复材料的需求也逐年增加。不同临床修复材料的特性不同，而3D打印技术作为一项新型数字化成型技术，可与临床计算机断层扫描、磁共振成像等结合，利用计算机辅助设计个性化植入物，实现对孔隙结构的精准控制，设计出与患者受损区域几乎完全相同的三维多孔高活性修复材料，以实现精准医疗和个性化医疗。文章综述了近年来运用3D打印技术制备生物医用材料在组织修复与治疗方面的研究进展，包括生物材料的配方、制备原理及制备方法，并总结了3D生物打印技术的局限性和面临的挑战。