双须骨舌鱼卵黄蛋白原基因vtg的克隆、组织表达和原核表达分析

为探究双须骨舌鱼(Osteoglossum bicirrhosum)卵黄蛋白原vtg基因的结构和表达特征,本研究运用RACE技术克隆双须骨舌鱼vtg全长c DNA序列。序列分析发现,双须骨舌鱼vtg的c DNA全长为5 325 bp,开放阅读框(ORF)为5 121 bp,其5′和3′非编码区(UTR)分别为46 bp和159 bp,共编码1 706个氨基酸,预测蛋白质分子量约为186.79 ku。同源性分析发现,双须骨舌鱼与同科的美丽仆骨舌鱼(Scleropages formosus)相似度达到84.78%,与鲤形目、鲈形目、鲱形目、鲽形目鱼类的相似度均高于50%。系统进化树分析结果显示,本文获得的双须骨舌鱼vtg基因与骨舌鱼目聚为一类,与鳗鲡目硬骨鱼类亲缘关系较近,与双须骨舌鱼进化地位相符。荧光定量PCR检测结果表明,在雌雄鱼性腺和肝中vtg均有表达,且在雌鱼肝中的相对表达量显著高雄鱼(P0.05),卵巢和精巢表达量无显著差异(P0.05);在雌雄鱼鳃、脾、肾、肌肉、心、头肾、脑等7个组织中均极微量表达,且无显著差异(P0.05)。在Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期卵巢中vtg相对表达量依次增加,Ⅳ期显著高于Ⅱ和Ⅲ期(P0.05),也显著高于精巢Ⅳ期(P0.05);在雌鱼肝组织中呈先增后减趋势,且Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期之间无显著差异(P0.05),但每个时期都显著高于雄性(P0.05)。成功构建了原核表达载体p EASY-Blunt E2-vtg,并转入Transetta(DE3)表达感受态细胞中成功诱导出融合蛋白。Western-blotting检测显示,融合蛋白可被抗His标签特异性识别。综上表明,vtg表达水平高低与性别相关,并与性腺发育程度有关。此外,本研究结果也为后续深入研究卵黄蛋白原的生理功能打下基础。     

禁食和复投喂对大口黑鲈胆囊收缩素及其受体基因表达的影响

为研究大口黑鲈(Micropterus salmoides) 胆囊收缩素(Cholecystokinin, CCK)和其受体(Cholecystokinin receptor, CCKR)基因在摄食活动中的功能, 研究通过克隆得到CCK1、CCK2、CCK1R和CCK2R基因的编码区序列, 其长度分别为414、387、1368和1359 bp, 分别编码137、128、455和452个氨基酸。荧光定量结果表明CCK1和CCK2基因均在脑组织中高表达, 其次为肠道组织, 而CCK1R和CCK2R基因分别在胆囊和脑组织中高表达。在摄食后24h内, CCK1、CCK2、CCK1R和CCK2R基因的相对表达量呈先升高后下降趋势, 其中CCK1、CCK1R和CCK2R基因在摄食后3h相对表达量达到最高值, 而CCK2基因在摄食后12h相对表达量达到最高值(P<0.05)。禁食过程中CCK1、CCK1R和CCK2R基因相对表达量在禁食14d时显著升高(P<0.05)。复投喂后CCK1、CCK1R和CCK2R基因的相对表达趋势与餐后表达趋势相似, 呈先升高后降低趋势。但在禁食和复投喂过程中CCK2基因相对表达量并无显著变化。综上所述, 研究结果推测CCK1基因可能与CCK1R、CCK2R基因结合, 作为饱腹信号因子, 通过抑制食欲调控大口黑鲈摄食、消化等生理过程; 而CCK2基因可能作为短期食欲因子调节摄食活动。研究结果可为大口黑鲈摄食活动调节提供理论依据。     

常用萃取剂提取福寿螺卵中类胡萝卜素的初步研究

【背景】福寿螺为世界性恶性入侵水生动物,也是我国公布的第一批外来人侵物种之一。福寿螺大量啃食为害水稻、茭白、白莲等重要农作物,对我国南方各省农业生产造成了巨大威胁,因此,预防和控制福寿螺灾害显得尤为重要。合理利用福寿螺能有效控制福寿螺的数量和危害,是生物防治的一个重要部分。福寿螺卵中含丰富的类胡萝卜素,充分利用螺卵中的类胡萝卜素能拓展福寿螺的利用途径和方法。【方法】为探寻福寿螺卵中类胡萝卜素的提取方法,本研究采用甲醇、无水乙醇、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷、石油醚等6种常用萃取剂提取福寿螺卵中类胡萝卜素,用紫外可见光分光光度计测定其含量。【结果】结果显示,不同萃取剂中类胡萝卜素的提取量不同,醇类为较适合的提取液（甲醇〉无水乙醇〉丙酮）。【结论与意义】本研究对福寿螺卵中类胡萝卜素的提取方法进行了探索和研究,找出了合适的提取液,为拓展福寿螺的利用途径,以及福寿螺的综合防治提供了参考。     

利用微卫星多重PCR技术鉴定剑尾鱼RR-B系

目的建立多重PCR技术鉴定选育剑尾鱼RR-B系的方法。方法根据可明显鉴定剑尾鱼RR-B系的6对特异性微卫星引物Msa012、Msa014、Msa033、Msb025、Msd003、Msd051,采用不同的组合方式对RR-B系剑尾鱼和红眼红体的非选育剑尾鱼进行多重PCR扩增。结果引物组合1(Msa014、Msb025、Msd003)和组合2(Msa012、Msa033、Msd051)两个三重PCR反应体系能清楚的扩增各个微卫星座位,且各目的片段之间无干扰,易于识别,引物组合1的排除概率为99.98%,引物组合2的排除概率为99.96%,能准确鉴定剑尾鱼RR-B系。结论本检测方法具有较高的稳定性,可快速准确鉴定剑尾鱼RR-B系。     

外来鱼类雀鳝与本地斑鳢功能反应的比较

为评估外来鱼类雀鳝对本地鱼类资源的捕食效率及与本地肉食鱼类摄食的差异, 研究对眼斑雀鳝(Lepisosteus oculatus)捕食鲮(Cirrhinus molitorella)、广东鲂(Megalobrama terminalis)和草鱼(Ctenopharyngodon idellus)的功能反应进行了实验研究, 并与本地生态位相似肉食性鱼类斑鳢(Channa maculata)的功能反应进行了比较。研究分析了雀鳝和斑鳢的功能反应类型, 建立了功能反应曲线, 估计了资源消耗率相关的参数, 并结合功能反应模型和食物转化效率模拟了2种鱼类的种群增长趋势。结果表明: 雀鳝与斑鳢的功能反应类型均为Type-Ⅱ型; 2种捕食者的袭击率(P=0.383)及食物处理时间(P=0.663)均无显著性差异, 表明2种捕食者在单位资源消耗率上并无明显差别; 雀鳝的相对生长效率显著高于斑鳢(P<0.05), 而食物转化效率则无显著差异(P=0.132); 雀鳝的种群增长快于斑鳢且具有更高的稳定种群密度。研究为系统评估外来鱼类雀鳝的生态影响提供了基础, 采用的量化功能反应的方法可为其他外来鱼类生态影响的评估提供借鉴和参考。     

福寿螺线粒体DNA COⅠ基因序列测定及分类地位

对国内6个地区共29个福寿螺(Apple Snails)个体mtDNA COⅠ基因进行了扩增和序列分析,并结合GenBank中报道的福寿螺6个种Pomacea canaliculata、P.insularum、P.diffusa、P.haustrum、P.paludosa、P.camena和Pila属P.conica的同源序列,对国内入侵福寿螺的分类地位与分子系统发育进行了分析。结果表明,扩增的mtDNA COⅠ基因序列长度为619bp,序列间未见插入和缺失,其中核苷酸多态位点99个,简约信息位点80个;碱基A、T、C、G平均含量分别为23.6%、39.1%、16.6%和20.7%,A+T的含量(62.7%)明显高于C+G的含量(37.3%);6个地区的福寿螺共有13种单倍型,广州、钦州和吉安分别有3种单倍型,茂名、厦门和成都分别有2种单倍型,而广州、厦门和钦州3个地区之间共享一种单倍型。进一步的分子遗传距离分析表明,这6个地区福寿螺个体与P.diffusa、P.haustrum、P.paludosa和P.camena的遗传距离为0.114～0.191,而与P.insularum和P.canaliculata的同源性较高,其中单倍型1、2、3、7、8、10、11、12与P.canaliculata的遗传距离为0～0.074,单倍型4、5、6、9、13与P.insularum的遗传距离为0.011～0.063。构建的分子系统树显示7个分支,分别为Pomacea属6个种和Pila属P.conica,其中单倍型1、2、3、7、8、10、11、12与Pomacea canaliculata聚成一支,单倍型4、5、6、9、13与P.insularum聚成一支。序列同源性、遗传距离和系统进化树分析结果表明,国内入侵福寿螺有P.canaliculata和P.insularum两个种,而且这两个种在入侵扩散过程中已相互混杂。本研究为今后开展福寿螺的资源调查、控制和管理等提供科学依据。     

橘色双冠丽鱼体色相关基因mc1r的组织表达分析

黑素皮质素受体1基因(mc1r)是动物体色形成的关键调控因子,为探讨mc1r基因在橘色双冠丽鱼(Amphilophus citrinellus)体色褪黑过程中的调控作用,本研究利用cDNA末端快速克隆(RACE)技术首次获得橘色双冠丽鱼mc1r的cDNA全序列,并利用荧光定量PCR分析了橘色双冠丽鱼体色变化不同时期和不同组织中mc1r基因的表达差异。获得cDNA全长序列1 699 bp,共编码氨基酸325个,开放阅读框(ORF)为978 bp,5′非编码区(UTR)497 bp,3′非编码区(UTR)224 bp。氨基酸序列和系统发育分析表明,橘色双冠丽鱼与人(Homo sapiens)、斑马鱼(Danion rerio)、大黄鱼(Larimichthys crocea)和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)相似度分别为55.1%、77.1%、90.15%和96.92%。荧光定量PCR结果表明,mc1r在橘色双冠丽鱼胚胎发育9个时期均有不同程度的表达,且随着胚胎发育表达量逐渐减少,推测在胚胎发育的早期阶段该基因的基础表达水平即可启动参与体色细胞形成的腺苷酸循环。在"黑色-灰白色-黄色"三个体色蜕变期,mc1r在尾鳍、鳞片、皮肤的表达均呈先降低再稍升高的变化趋势,均在灰白色过渡期呈现最低值,推测这与mc1r和Agouti存在竞争性结合,及mc1r、tyr、tyr1三者是否处于适当、平衡状态有关。橘色双冠丽鱼长至近成鱼期,非正常褪黑鱼(即未完全褪黑)各组织mc1r表达量均比正常褪黑鱼(完全褪黑)高,其中皮肤组织的相对表达量显著高于正常褪黑鱼(P 0.05),可见鱼体体表褪黑程度与mc1r表达量呈负相关。在成熟鱼体11个组织中mc1r均有不同程度的表达,其中,鳞片显著高于其他组织(P 0.05),说明橘色双冠丽鱼mc1r的主要表达部位是鳞片。本研究通过了解体色变异相关基因表达特征,为鱼类体色遗传和体色改良研究积累资料。     

布氏罗非鱼微卫星位点筛选和群体遗传多样性分析

为阐明布氏罗非(Tilapia buttikoferi)群体遗传变异和遗传结构状况,采用50个尼罗罗非鱼特异性的微卫星分子标记对45个布氏罗非鱼个体进行遗传检测.结果有27对引物能获得稳定的特异性条带,占总数的54%,其中16个多态性微卫星座位共检测出52个等位基因.每个座位的等位基因数为2～6之间,平均每个座位为3.24;平均观测杂合度(Ho)为0.5266,平均期望杂合度(He)为0.5237,平均多态信息含量为0.4652,表明布氏罗非鱼群体遗传多样性较丰富,种群结构处于合理状态.     

叉尾斗鱼种群遗传变异与亲缘地理

通过分析采自珠江、鉴江、漠阳江、赣江、韩江、黄冈河、九龙江和闽江8个流域23个采样点121尾叉尾斗鱼mtDNA控制区3'端和临近序列共400bp,研究其种群遗传变异和亲缘地理格局。所分析序列只有13个变异位点,共有11个单倍型,碱基序列总的单倍型多样性为0.576,核苷酸多样性为0.00818,均较低。珠江流域存在群体内独有单倍型,有两个广布单倍型H1和H2,分别占所有样品的19%和62%。最小进化网络图显示单倍型没有明显的亲缘地理格局,呈星状发散,H1和H2处于中心。AMOVA分析显示变异主要来自地理区内群体间,歧点分布和中性检测显示叉尾斗鱼并未经历种群扩张。结果表明叉尾斗鱼种群遗传多样性很低且存在地理差异;各流域个体呈混杂分布格局,现有群体可能在珠江流域有东西两个起源;推测种群最近经历严重瓶颈效应。     

美丽硬仆骨舌鱼mtDNA D-loop区遗传变异特征

采用直接测序法分析美丽硬仆骨舌鱼(Scleropages formosus)3个种群(金龙鱼、红龙鱼和青龙鱼)共24个个体的线粒体D-loop区的遗传变异特征。经序列比对、分析,金龙鱼、红龙鱼和青龙鱼的D-loop序列不仅在个体间存在位点序列的变异(17个简约性信息位点),而且还存在序列长度的多态性(长度为915-924 bp),这种长度的差异在于存在不同碱基长度的微卫星序列。3种龙鱼碱基组成基本一致,G含量偏低。定义了10种单倍型,但金龙鱼、红龙鱼和青龙鱼间没有共享单倍型,单倍型多样度较高(0.667-1.00),核苷酸多样度较低(0.001 09-0.003 23)。AMOVA分析显示,变异主要来自地理区内不同群体间,个体间遗传距离为0-0.008 7,显示遗传变异仍处于种内水平。NJ、MP和Bayesian构建的分子系统树拓扑结构基本一致,但不能有效地反映金龙鱼、红龙鱼和青龙鱼间的亲缘关系。