机械拉伸下人肺上皮细胞增殖及整联蛋白再分布

应用体外周期性拉伸装置研究机械拉伸对人肺上皮细胞A5 4 9增殖及其膜表面受体———整联蛋白α5、β1再分布的调控作用。结果表明 :在应变为 15 % ,频率为 2 0次 /min、4 0次 /min的拉伸刺激下 ,4 8h后 ,应用流式细胞技术检测细胞的增殖活性指数明显降低 ,A5 4 9细胞的DNA合成受到显著抑制。在 4 0次 /min的拉伸频率下 ,整联蛋白α5、β1的分布发生重组并向基底层转移 ,形成局部粘附连接。研究表明 :整联蛋白α5、β1可能在肺上皮细胞感应机械应力过程中起了重要的作用。     

东方鲎C因子的分段克隆及表达

东方鲎C因子 (factorCfromTachypleustridentatus)是鲎血细胞中的一种对内毒素敏感的丝氨酸蛋白酶原 ,它与内毒素特异结合的特性 ,使之具有很大的应用价值。根据报道的C因子序列 ,设计了两对引物 ,以中国福建沿海的东方鲎 (Tachypleustridentatus)为材料抽提其血细胞总RNA ,首次用RT PCR的方法分两段扩增了鲎血中编码C因子蛋白的基因全序列。序列分析表明 ,得到的FC基因与文献报道的来自日本的东方鲎的FC有很高的同源性。将分段克隆得到的两段FC片段经相应酶切后 ,与含T7启动子的质粒 pET 2 8a( )在一个体系中作连接反应 ,构建表达质粒pET2 8a FC ,转化大肠杆菌BL2 1(DE3) ,筛选表达菌株。表达菌株经 1mmol/LIPTG诱导表达 2 .5h后 ,收集菌体并超声破菌。经SDS PAGE分析表明 ,在 110kD左右处有明显的表达条带 ,大小与FC的计算分子量相吻合。但表达产物以包涵体形式存在。经洗涤与变复性后 ,重组FC在体外表现出明显的抑菌活性。同时蛋白质印迹实验也提示了在大肠杆菌中FC的单基因表达物可能发生部分自剪切反应 ,而形成了额外的免疫印迹条带     

HTLV—1转录激活因子Tax和Taxreb107的相互作用

Tax是人类T淋巴细胞白血病病毒编码的转录因子。核糖体蛋白RpL6又称Taxreb10 7,是Tax应答序列结合蛋白 ,二者均作用于HTLV 1的启动子LTR。用酵母双杂交法和GST下拉检测 (pull down)法研究了Tax和Taxreb10 7/RpL6之间的相互关系。结果显示 ,二者在酵母细胞内和体外均具有直接相互作用。这些结果提示Taxreb10 7/RpL6可能通过与Tax的相互作用而调节Tax在病毒感染中的作用     

VLDL—受体重复序列的诱变缺失与配体结合力的关系

极低密度脂蛋白受体 (VLDL R)的配体结合域上存在 8个富含半胱氨酸的重复序列 (ligand bindingre peats,LBR) ,被认为是与配体结合的部位。该受体与含 7个类似重复序列的低密度脂蛋白受体 (LDL R)配体结合特性明显不同。为了明确VLDL R中 8个LBR在与配体结合中的作用并探讨VLDL R与LDL R结合特性差异原因 ,采用基因缺失诱变方法 ,构建了各种不同重复序列缺失的VLDL R重组体。将其分别导入无LDL R功能性表达的ldl A7细胞。转染细胞与荧光标记的VLDL、β VLDL及LDL的结合实验结果表明 ,LBR1和LBR2对结合富含apoE的脂蛋白 (VLDL ,β VLDL)最为重要 ;LBR3和LBR6对结合VLDL也有重要作用 ,但对结合 β VLDL无明显影响。结果同时表明 ,LBR7缺失的VLDL R表现出部分LDL R的结合特性 ,提示该重复序列可能是VLDL R与LDL R配体结合特性差异的部分原因     

粪产碱杆菌青霉素G酰化酶在枯草芽孢杆菌中的表达、纯化及其性质

利用PCR技术克隆了粪产碱杆菌 (Alcaligenesfaecalis,CICCAS1.76 7)青霉素G酰化酶 (pencillinGacylase ,PGA)基因 (GenBank登录号AF4 5 5 35 6 )。通过构建工程菌E .coli(pETAPGA) ,该酶在大肠杆菌中获得了表达 ,表达产物分泌到周质空间。进一步构建的工程菌B .subtilis (pMAPGA)和B .subtilis(pBAPGA)实现了该酶的胞外分泌表达。分泌表达的最高表达量为 6 5 3u/L ,比野生型A .faecalis表达量高 10 9倍。表达产物经硫酸铵分级沉淀和DEAE SepharoseCL 6B两步纯化 ,纯度提高 86倍 ,活力回收率达到 81% ,纯化后的PGA活力为 1.4 6 9u/mg。研究表明 ,PGA家族成员中只有粪产碱杆菌PGA和巨大芽孢杆菌PGA可以在枯草芽孢杆菌中分泌表达。与巨大芽孢杆菌PGA相比 ,粪产碱杆菌PGA的最适pH值为 8.0 ,最适温度为 6 0°C ,而且在有机溶剂中具有更强的稳定性。该酶在水相中具有较低的头孢氨苄合成活力。本研究为粪产碱杆菌PGA的获得提供了新的途径。     

一种使用混合PCR筛选技术高效延伸水稻BAC—重叠群的方法

使用“克隆连克隆 (clonebyclone)”战略进行水稻基因组测序需要依赖于构建好的基因组物理图。工作着眼于水稻籼稻广陆矮 4号 (OryzasativaindicaGuangLuAi4)第四号染色体长臂上 5 6 .1～ 6 8cM的区域 ,采用PCR方法筛选BAC全库来延伸重叠群 ,构建物理图。通过参照特异遗传探针定位的BAC克隆 (seedBAC)末端序列设计了 14对引物 ,按特定规则分成 3组 ,分别以代表水稻BAC库 (共 2 2 36 8个BAC )的 2 33个BACpool为模板进行PCR反应 ,一共获得了 6 5个阳性BAC克隆 ,通过末端测序、酶切杂交等方法确定了其中 2 9个BAC克隆作为有效延伸的克隆 ,延伸了 8个重叠群。通过酶切杂交、末端测序等方法还获知阳性BAC的延伸方向、延伸长度以及与seedBAC之间的重叠长度。8个重叠群总的延伸长度达到5 10kb。与实验室原用于作物理图的其他方法如指纹图、点杂交等相比 ,该方法有高效率、高灵敏度、专一性好、可重复使用等优点。创新之处在于通过引物的合理分组和PCR实验条件的改进降低了假阳性和假阴性率     

NGX6基因单核苷酸多态及与鼻咽癌的相关性

NGX6基因是本研究室在鼻咽癌 9p最小共同缺失区内新克隆的鼻咽癌候选抑瘤基因。通过采用病例 对照研究方法 ,利用动态等位基因杂交 (DASH)技术对 10 5例鼻咽癌患者和 183例正常人NGX6基因的 2个单核苷酸多态 (SNP)进行了分型 ,经相关分析发现 ,位于NGX6基因上游调控区的SNPrs8792 84与鼻咽癌发病存在显著相关性 ,基因型CT和TT的相对危险度分别为 3.93和 2 .2 7。实验结果进一步支持了NGX6基因与鼻咽癌的发生发展可能存在密切关系 ,SNPrs8792 84由于处在NGX6基因上游调控区域 ,其多态类型可能在某种程度上影响NGX6基因的表达调控 ,从而与鼻咽癌发病相关