过表达漆酶基因Lelcc1的香菇菌株构建及表型分析

真菌漆酶（laccase）是一种多酚氧化酶,在真菌生长发育中具有重要作用。本研究采用根癌农杆菌介导转化的方法,以香菇Lentinula edodes菌株W1为受体菌株,在Leactin基因启动子调控下过表达Lelcc1基因;对其中7个单拷贝插入的转化子进行qRT-PCR分析,7个Lelcc1基因表达量较出发菌株W1均上调了1.5-8倍。进一步分析了这7个转化子的遗传稳定性;挑取了3个稳定的转化子进行表型分析,主要包括不同培养基中的生长速度、代料栽培过程中菌棒转色程度、以及透射电镜观察菌丝细胞的超微结构。发现转化子和受体菌株W1的生长速度无显著差异,但代料栽培过程中转化子较W1转色更快,菌棒表面颜色更深;透射电镜观察菌丝细胞的超微结构发现在细胞壁厚度、细胞膜形态等方面,其中两个超量表达转化子与W1间存在显著差异。结果表明,香菇Lelcc1基因可能参与了转色过程中色素合成或积累,也可能与细胞壁形成有关。     

生长素及其类似物增强香菇耐高温性的研究

高温胁迫影响香菇的品质和产量。以香菇Lentinula edodes热敏感菌株YS3357为试验材料,研究了外源生长素及其类似物对香菇菌丝体高温胁迫下氧化损伤的缓解效应。结果表明,外源添加IAA、NAA和2,4-D能够显著提高热敏感菌株YS3357的耐热能力。外源生长素类物质在一定程度上可以抑制超氧阴离子（O ^2-）产生,降低脂氧合酶（LOX）活性和硫代巴比妥酸反应物（TBARS）含量,提高超氧化物歧化酶（SOD）活性,可能与缓解香菇菌丝体由于高温胁迫所引起的氧化损伤有关。本研究重点探讨外源添加生长素及其类似物对热胁迫下香菇热敏感菌株YS3357菌丝生长、生理特性及抗氧化胁迫能力的影响,为进一步阐明食用菌抗高温胁迫机制奠定了一定的理论基础。     

RNAi法分析香菇邻氨基苯甲酸合酶基因功能

邻氨基苯甲酸合酶（TrpE）是生物体内一种重要的逆境诱导蛋白,其在逆境条件下的响应保证了生物体生存相关产物的正常代谢。本文以香菇Lentinula edodes栽培菌株S606为试验材料,以LeTrpE功能结构保守区域395bp的反向互补片段为干扰片段,构建LetrpE基因双向启动子RNAi载体;采用根癌农杆菌介导转化法侵染香菇菌丝,通过PCR方法检测DNA插入片段,获得11个阳性转化子;实时荧光定量PCR分析结果表明,2个转化子LetrpE基因表达量较野生型菌株下调了2-3倍,确认其为LetrpE基因RNAi转化子;菌丝体在40℃高温处理24h后,检查到吲哚-3-乙酸合成途径中基因LeTam-1在野生菌株S606表达量上调,而在2个RNAi转化子中表达量下调;RNAi转化子菌丝体在25℃下不能恢复生长,而野生型菌丝体可以恢复生长。研究表明,香菇LetrpE基因的功能与耐热性有关。     

香菇HMG-box转录因子lelcrp1基因的功能

【目的】研究香菇(Lentinula edodes) HMG-box转录因子LELCRP1 (Lentinula edodes lignocellulase genes regulation protein 1)在木质纤维素降解相关酶基因表达中的功能与作用。【方法】通过double-joint及同源重组方法构建lelcrp1基因RNAi载体,采用根癌农杆菌介导转化的方法转入香菇异核菌株W1菌丝中,筛选得到RNAi转化子,通过Southern杂交检测插入片段在菌株W1基因组中的拷贝数量。采用荧光定量PCR检测RNAi转化子木质纤维素降解酶基因表达水平变化,并在含有3.5μg/mL潮霉素的MYG平板上测定RNAi转化子的菌丝生长速度。【结果】获得了4个lelcrp1基因表达水平与出发菌株W1相比显著下调6–7倍的RNAi转化子。Southern杂交结果显示,lelcrp1基因RNAi片段已成功整合至香菇菌株W1基因组内,并以单拷贝形式存在。对其中2个RNAi转化子的26个木质纤维素降解酶基因表达水平进行分析,发现其中9个纤维素酶基因、1个半纤维素酶基因、2个辅助酶AA9基因和1个锰过氧化物酶基因的表达水平均表现出明显的下调。平板生长试验表明,RNAi转化子菌丝生长速度均显著慢于出发菌株W1。【结论】通过RNAi技术成功抑制了香菇异核菌株中lelcrp1基因表达水平,并导致部分纤维素及木质素酶基因表达水平相应下调,首次发现HMG-box结构域的转录因子能调控木质纤维素降解相关酶基因表达。