Cre/Loxp和四环素系统在基因可控表达中的应用

本文介绍了目前最常见的四环素调控系统和Cre/LoxP系统的基本原理、应用情况、近年来的研究进展总结,比较了两种系统的优缺点,介绍了两种系统联合应用的成果,并且提出了Cre/Loxp系统在HPV11全基因组定向表达中的应用,并由此提出利用Cre/Loxp系统解决多个基因定向表达问题的设想。     

高压高温灭菌前后纳米氢氧化铝佐剂理化性质的对比研究

目的 对比高温高压处理前后纳米氢氧化铝佐剂的理化性质变化。方法 通过测定浊度、pH值和粒径对比121℃ 30min高压灭菌锅处理纳米氢氧化铝前后的变化。结果 浊度没有明显的变化,pH值在经过高温高压处理后有轻微的降低,粒径变化没有变化。结论 纳米化氢氧化铝佐剂在疫苗的制备过程中可以使用高温高压处理灭菌。     

铝佐剂作用机制及其在人用H5N1灭活疫苗中的辅佐 作用

氢氧化铝佐剂已经使用了80余年, 其免疫增强作用已经被人们证实, 但是其详细的机理以及在使用中存在的问题尚未彻底阐明。HPAIV H5N1在世界范围内的发生引起人们的广泛关注与焦虑。有效的控制措施就是进行预防接种, 但是目前使用的人用HPAIV H5N1灭活疫苗尚在研究当中, 也存在一些问题。研究证实氢氧化铝佐剂的加入使该疫苗在达到相同抗体滴度的情况下可以减少抗原的用量。综述了HPAIV H5N1在氢氧化铝辅佐下的一些新认识, 并对辅佐新型疫苗的开发应用前景进行了展望。     

AphA蛋白促进副溶血弧菌c-di-GMP合成和生物膜形成

【目的】综合运用表型和分子生化实验研究AphA蛋白对副溶血弧菌生物膜形成的调节机制。【方法】利用菌落褶皱和结晶紫染色实验比较aphA突变株(ΔaphA)和野生株(WT)的表型差异;进而利用色谱串联质谱(HPLC-MS/MS)的方法分别检测ΔaphA和WT中c-di-GMP分子含量;提取ΔaphA和WT的总RNA,采用实时定量RT-PCR的方法研究AphA对scrABC和scrG的调控关系;分别构建克隆有scrABC和scrG上游启动子区的LacZ重组质粒,并将重组质粒转入ΔaphA和WT中,通过测定并比较两株菌中β-半乳糖苷酶活性差异来进一步研究AphA对scrABC和scrG的调控关系;PCR扩增scrABC和scrG的整个启动子区DNA序列,并纯化His-AphA蛋白,通过凝胶阻滞实验(EMSA)验证AphA对靶基因启动子区是否具有直接的相互作用。【结果】表型结果显示AphA能促进c-di-GMP的合成和生物膜形成;实时定量RT-PCR和LacZ结果表明AphA能抑制scrABC和scrG的转录表达;EMSA结果证明AphA不能结合到scrABC和scrG的启动子区DNA上。【结论】AphA间接抑制scrABC和scrG的表达是其促进副溶血弧菌c-di-GMP合成及生物膜形成的机制之一。     

副溶血弧菌ToxR截短体蛋白的表达纯化及其DNA结合活性

【目的】利用大肠杆菌BL21λDE3表达系统,表达出有活性的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus,VP)ToxR截短体蛋白,为进一步研究ToxR的转录调控机制奠定基础。【方法】以VP基因组DNA为模板,PCR扩增ToxR蛋白DNA结合结构域(ToxR-N)的DNA片段,并将其直接克隆入pET28a中,获得重组质粒;将重组质粒导入大肠杆菌BL21λDE3中,所得菌株经IPTG诱导后能表达出His-ToxR-N蛋白。利用限制级凝血酶切除His-ToxR-N中的His-标签,进而以VP的calR和VP1687为靶基因,通过体外的凝胶阻滞实验(EMSA)验证ToxR-N蛋白的DNA结合活性。分别构建克隆有calR和VP1687上游启动子区的LacZ重组质粒,并将重组质粒转入野生株(WT)和toxR突变株(ΔtoxR)中,通过测定β-半乳糖苷酶活性来比较两株重组菌中靶基因启动子活性,以验证ToxR对calR和VP1687的调控关系。【结果】成功表达出有活性的ToxR-N蛋白,该蛋白对calR启动子区具有结合活性。LacZ结果显示ToxR对calR的转录具有激活作用,而对VP1687的转录具有抑制作用。【结论】所表达的ToxR-N可用于后续的转录调控机制研究;ToxR通过直接激活calR的转录表达,而间接抑制T3SS1相关基因的表达。