抑制eIF3I蛋白的泛素化降解促进人宫颈癌细胞增殖

目的:研究eIF3I蛋白在细胞中的泛素化修饰,阐明其对人宫颈癌细胞系Hela增殖的影响.方法:通过点突变技术获得突变体K282R,与野生型eIF3I比较泛素化的水平,研究细胞内的泛素化修饰调控.经流式细胞仪分析细胞周期,研究野生型蛋白eIF3I和突变体K282R对Hela细胞的细胞周期影响.再从周期蛋白水平研究eIF3I对细胞增殖的调控作用.结果:突变体K282R比野生型eIF3I蛋白的外源表达量大.在Hela细胞中K282R突变体的泛素化水平低,抑制了该蛋白的泛素-蛋白酶体途径降解.过表达eIF3I能上调周期蛋白Cyclin D1的表达量,促进细胞进入由G1期进入S期.同时,泛素化程度低的突变体K282R具有较强的促进细胞增殖的作用.结论:抑制eIF3I的泛素-蛋白酶体途径降解能上调周期蛋白CyclinD1的表达,促进肿瘤细胞增殖,提示eIF3I在细胞增殖和肿瘤发生发展中发挥作用.     

效应蛋白LepB的表达,纯化及其亚克隆片段的结晶研究

为了研究嗜肺军团菌通过其效应蛋白发挥的致病机理,效应蛋白的结构和生物学功能研究是至关重要的。我们构建了效应蛋白LepB全长载体PFastBac1,应用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统成功表达了全长LepB蛋白,并构建9个LepB亚克隆的原核表达载体PGEX-1,通过GST亲和层析,离子交换层析,凝胶过滤层析,纯化得到了纯度较高的蛋白片段。通过悬滴气相扩散法进行蛋白结晶筛选,获得了效应蛋白LepB片段480~679的蛋白晶体,为解析效应蛋白LepB的结构和生物学功能研究奠定基础。     

SidK-VatA蛋白复合物的表达和纯化

军团菌以吞噬泡的形式进入宿主细胞,借助宿主细胞环境进行自身的繁殖传代。为避免被宿主识别,通过分泌自身效应蛋白来逃避宿主对含病原菌液泡（legionella containing vacuoles,LCVs）的识别和消化,军团菌通过分泌效应蛋白SidK结合宿主v-ATPase,抑制v-ATPase对吞噬泡的酸化,以实现吞噬泡不被溶酶体消化。在大肠杆菌中表达了效应蛋白SidK,利用昆虫细胞表达了VatA（v-ATPase）蛋白,得到了均一性较好的SidK-VatA蛋白复合体,为进一步解析这个复合体的结构奠定了基础。     

单细胞测序技术在肝脏疾病的应用与展望

新兴的单细胞测序技术能够从单细胞水平揭示基因组、转录组和表观遗传学等分子水平发生的基因变异与表观修饰状态,也可用于鉴定新的细胞类型和表面标记物。这将帮助人们探明疾病发生时细胞基因、转录或表观修饰方面的变化,了解细胞之间的联系,以及深入理解肿瘤异质性。目前,单细胞测序技术已用于多种疾病的研究,其在肝脏疾病,包括肝硬化、肝癌中已有相关成果。于此,综述了单细胞测序技术在肝脏发育及肝病中的应用,讨论了肝脏疾病发生的内在机制以及该技术仍存在的问题,提出可能的解决方案,如发展三维单细胞测序技术将更能帮助人们深刻理解肝脏疾病发生机制。     

高表达trip-1蛋白对大鼠肾小管上皮细胞转分化的影响

目的:研究上调大鼠肾小管上皮细胞中trip-1蛋白的表达量对TGF-β1诱导的上皮细胞转分化的影响.方法:包装人TRIP-1基因重组腺病毒,用其感染NRK52E细胞36h上调内源性trip-1蛋白表达量,之后用10 ng/ml的TGF-β1对细胞进行刺激诱导,72h后做Western Blot检测细胞中E-cadherin蛋白和α-SMA蛋白表达量.结果:①包装的人TRIP-1基因重组腺病毒感染细胞能够有效上调细胞中trip-1蛋白的表达量.②上调细胞中trip-1蛋白表达量,对TGF-β1引起的NRK52E细胞中E-cadherin蛋白表达水平降低有所抑制,但对TGF-β1引起的NRK52E细胞中α-SMA蛋白表达水平升高没有明显调节作用.结论:上调大鼠肾小管上皮细胞中trip-1蛋白的表达量在一定程度上抑制了TGF-β1诱导的NRK52E细胞转分化.     

Ezrin多克隆抗体制作及应用

构建Ezrin原核重组表达载体pET-28a(+)-ezrin,将其转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,诱导获得Ezrin蛋白,将经镍柱亲和层析纯化后的蛋白分别免疫新西兰大耳兔和昆明小鼠(KM),获得抗血清,采用ELISA和Western blotting,免疫荧光测定其效价和特异性。ELISA对抗血清进行效价测定表明抗血清可与抗原发生特异性免疫反应;通过Western blotting对抗血清进行鉴定表明抗血清可以识别几种细胞株内的特异性条带,其相对分子量为82 kD,与预测分子量相符;免疫荧光试验表明抗血清可以识别细胞内的Ezrin蛋白,且定位情况与文献报道相符。最后通过protein G对抗血清进行了纯化。结果表明用该方法制备的Ezrin多克隆抗体有较高的特异性和灵敏度。     

Ezrin蛋白信号转导通路及其对肿瘤侵袭转移的最新进展

肿瘤转移是一个多阶段、多途径、涉及多基因及其信号通路变化的一系列复杂过程。了解肿瘤转移相关基因的信号传导通路以及对肿瘤转移的作用机制,为寻找抑制肿瘤转移的关键靶点具有重要的意义。Ezrin高表达与肿瘤转移密切相关,它可通过改变肿瘤细胞极性及细胞运动、调节肿瘤细胞间黏附及细胞与细胞外基质黏附、参与肿瘤细胞内信号转导而影响恶性肿瘤转移。Ezrin过度表达可以破坏正常细胞内信号传递网络的平衡,其中主要涉及的为细胞信号转导相关分子(Rho)及受体酪氨酸蛋白激酶等信号传导途径。Ezrin借助于细胞内错综复杂的信号转导网络调控细胞的形态构成、黏附、吞噬、运动、血管形成等一系列的生物学过程,最终实现肿瘤细胞的侵袭和转移。本文就Ezrin蛋白的信号转导通路及其对肿瘤转移作用的研究进展做一综述。     

青蒿琥酯纳米颗粒的制备及其体外抑制肿瘤细胞增殖的作用研究

目的：用壳聚糖（Chitosan,CS）和三聚磷酸钠（tripolyphosphate,TPP）交联制备包载青蒿琥酯纳米粒,并探讨其在体外对肿瘤细胞增殖的抑制作用。方法：以壳聚糖-三磷酸钠（CS／TPP）为基质并优化其比例,采用离子凝胶法制备包载青蒿琥酯（ART）纳米粒,对其进行表征包括粒径大小、Zeta电位、包封率、载药量和体外释放试验,以及红外光谱分析。用MTT法检测包栽青蒿琥酯的壳聚糖·三磷酸钠纳米粒对Hela、Caski、U251、MCF-7和HepG2细胞增殖的抑制作用。结果：成功构建青蒿琥酯一壳聚糖．三磷酸钠纳米颗粒（ARTnanoparticals,ART-NPs）,平均粒径为166．8±0．2nnl,电位为10．2±0．79mV,红外光谱分析表明CS厂rPP成功连接并包裹ART,平均载药量和包封率分别为18％和74．82％;体外释放呈典型的双相分布,前24h呈暴发性释放（44．2％）,其后缓慢释放,第9天累积释放度达67．4％。对不同肿瘤细胞的杀伤作用呈浓度和时间依赖趋势,且ART-NPs作用优于单-ART;相同浓度的ART-NPs在96h时对细胞增殖的抑制率明显高于ART组（P〈O．05）。结论：用壳聚糖和三磷酸钠交联可成功包载青蒿琥酯制成具有缓释性的纳米制剂,对肿瘤细胞的生长具有明显的抑制作用,有潜在的肿瘤治疗价值。     

壳聚糖介导CrmA基因治疗小鼠肝纤维化的研究

目的：探讨壳聚糖介导的CrmA对小鼠肝纤维化的治疗效果,以期为肝纤维化的基因治疗提供实验基础。方法：清洁级的75只雄性小鼠随机分为正常组、模型组、壳聚糖介导的CrmA组、壳聚糖介导的空载体组、壳聚糖组,每组15只。应用30％四氯化碳橄榄油溶液3ml／kg腹腔注射制备肝纤维化小鼠模型。治疗8周后,眼眶取血,检测血清的肝功能指标,并取肝组织做HE染色,观察各组小鼠肝脏的病理形态,Real TimePCR检测肝组织IL-1β、α-SMA、TGF—β1、TIMP-1表达量。结果：与模型组小鼠相比,壳聚糖介导的CrmA组小鼠的肝纤维化程度减轻,ALT、AST显著降低（P〈0．01）,肝组织IL-1β、α-SMA、TIMP1、TGF-β1的表达明显减少（P〈0．05）,而模型组、壳聚糖介导的空载体组和壳聚糖组均无显著性差异。结论：壳聚糖介导的CrmA能有效减轻肝纤维化小鼠的肝脏损伤和纤维化程度,为基因治疗肝纤维化提供了一种潜在的新思路和方法。     

姜黄素对宫颈癌细胞生长与增殖的影响研究

目的:探究姜黄素(Curcumin)对宫颈癌细胞He La生长与增殖的影响及其作用机制。方法:体外培养He La细胞,以0μmol·L~(-1)、5μmol·L~(-1)、10μmol·L~(-1)和20μmol·L~(-1)等不同浓度的姜黄素处理He La细胞;通过MTT和平板克隆实验,研究姜黄素对He La细胞生长与增殖的影响;通过免疫荧光共聚焦显微镜技术,研究姜黄素与上游结合因子(Upstream binding factor,UBF)在细胞中的定位情况;通过实时定量聚合酶链式反应(Q-PCR)实验,研究姜黄素对He La细胞核仁r DNA转录的影响;利用Western blot技术,研究姜黄素对He La细胞中UBF磷酸化的影响。结果:姜黄素对He La细胞有明显的生长抑制作用,并呈现出剂量依赖关系;姜黄素降低r DNA的转录水平,下调UBF磷酸化的量,且和UBF在核仁中存在共定位现象。结论:r DNA转录水平的降低和p-UBF的下调可能是姜黄素抑制He La细胞生长和增殖的作用途径之一。