表达猫瘟热病毒VP2蛋白重组腺病毒的构建及其免疫原性研究

为构建能表达FPV VP2蛋白的重组犬2型腺病毒(CAV-2)载体.首先用PCR方法从FPV GT-2株细胞培养物中扩增出了VP2蛋白基因,将其克隆到真核表达质粒pVAX1中构建了含有FPV vp2基因的表达盒(CMV-VP2-PolyA),将该表达盒酶切后定向克隆到含有CAV-2 E3区的穿梭质粒pVAX△E3中,构建出pVAX△E3VP2.用Sal I+Nru I双酶切pVAX△E3VP2,回收含有目的基因表达盒部分,将其定向克隆入含有CAV-2全基因组的骨架质粒pPoly2-CAV-2中,构建了重组质粒pCAV-2-FPV-VP2.Cla I+Asc I酶切pCAV-2-FPV-VP2释放出重组基因组,以此转染MDCK细胞,获得了重组病毒CAV-2-VP2.该重组病毒能使MDCK细胞产生腺病毒样细胞病变.Western blot检测证实,该重组病毒能表达具有免疫学活性的VP2蛋白.该重组病毒可以有效地诱导免疫猫产生抗FPV和CAV-2抗体.本实验表明该重组病毒有可能成为一个FPV的疫苗株.     

犬冠状病毒流行株膜蛋白基因序列分析及其表达研究

对国内分离的犬冠状病毒(CCoV)DXMV、V1和V2流行毒株膜蛋白(M)基因进行了扩增、测序和遗传进化分析。3个CCoV流行毒株M基因全长均为792bp,编码263个氨基酸,其中前17个氨基酸为信号肽。DXMV、V1和V2流行株与Insavc-1疫苗株M基因相比,核苷酸的同源性分别为92.6%、90.9%和91.6%,推导的氨基酸序列的同源性分别为92.5%、92.0%和92.3%,在M基因前1/3区域内存在变异,其中74-76、120-124和131-135三个区域变异较大。国内DXMV、V1、V2、NJ1和NJ1-175个流行株M基因核苷酸同源性为96.6%,推导的氨基酸序列同源性为96.4%,显示出很高的保守性。基于M基因的遗传进化分析表明,目前国内绝大多数CCoV流行毒株都属于CCoV基因II型,只有Fox3-1和Rac2-1两个毒株属于基因I型。另外,将DXMV株M基因亚克隆到pET28a中,在BL21(DE3)中实现了M蛋白的表达,表达量约占菌体蛋白的10.2%。     

犬瘟热病毒核蛋白基因重组腺病毒的构建、鉴定与表达

核蛋白基因(N)位于犬瘟热病毒基因组的108-1679位置处,是保守性较强的免疫原性蛋白,因此选择N基因作为目的基因,利用酶切、连接等方法构建了含犬瘟热病毒核蛋白基因的穿梭质粒pVAXAE3LPN.以含CAV-2 SY株全基因组的pPoly2-CAV-2为载体,构建了重组质粒pCAV-2-CDVLPN,利用脂质体介导法转染MDCK细胞,转染三次后,细胞出现了典型的腺病毒样病变.电镜负染、切片观察,酶切、PCR.扩增及测序鉴定的结果表明表达犬瘟热核蛋白基因的重组犬2型腺病毒构建成功,表达的核蛋白分子量为58kDa.     

连作大豆根分泌物对根腐病病原菌的化感作用

采用砂培,水培和室内培养等试验方法研究了连作大豆根分泌物对根腐病病原菌的化感作用。结果表明,与对照相比,连作和轮作大豆根分泌物对半镰孢菌,粉红粘帚功和尖镰孢菌尤其是对半裸镰孢菌的生长有明显的化感促进作用,差异达显著或极显著水平,低浓度时,连作大豆根分泌物对半裸镰孢菌和粉红粘帚菌生长的化感促进作用明显大于轮作大豆,差异达显著水平,同一茬口,高浓度根分泌物半裸镰孢菌生长的化感促进作用小于低浓度,而且在连作大豆中差异达显著水平。与对照相比,高浓度的邻苯二甲酸和丙二酸（L5和B5）对半裸镰孢菌,粉红粘帚菌和尖镰孢菌尤其是对半裸镰孢菌的生长有化感抑制作用,差异达显著或极显著水平,而低浓诬的邻苯二甲酸和丙二酸对半裸镰孢菌,粉红粘帚菌和尖镰孢菌的生长有化感促进,部分差异达显著水平。     

大豆根茬腐解产物的鉴定及化感作用的初步研究

采用ＧＣ－ＭＳ分析法鉴定了培养试验获得的大豆茬腐解２周、４周产生的有机化合物的酸、碱性组分产物,并对腐解２周、４周、８周各组分产物进行了化感作用的研究。结果表明：大豆根茬腐解产物（含微生物菌源根际土中的有机化合物）十分丰富,有酸类、酯类、醇类、醛类、酚类、烃类等物质,其中有些有机化合物已被研究证明是化感物质,还有些未见报道;不同腐解时间产生的有机化合物有一定差异;对腐解决物进行生物检测试验,发现大     

重迎茬大豆根际土壤有机化合物的初步鉴定及对大豆种子萌发的化感作用

采用气相色谱－质谱联用技术（ＧＣ－ＭＳ）鉴定了用无水乙醇浸提的结荚期重迎茬大豆根际土壤有机化合物,并对其化感作用进行了初步研究,结果表明,重迎茬大豆根土壤中主要含有有机酸类、酯类、醇类、酮类、醛类、苯类、酚类、烃类及萘、呋喃类等有机化合物;其中包含很多普被报道过的化感物质,在本试验的根本土壤用量条件下,其醇提液对大豆种子萌发及胚根生长未表现出化感作用,这可能与其致害浓度有关,此外,本文还探讨了化感     

表达猫瘟热病毒VP2蛋白重组腺病毒的构建及其免疫原性研究

为构建能表达FPV VP2蛋白的重组犬2型腺病毒(CAV-2)载体。首先用PCR方法从FPV GT-2株细胞培 养物中扩增出了VP2蛋白基因,将其克隆到真核表达质粒pVAX1中构建了含有FPV vp2基因的表达盒(CMV- VP2-PolyA),将该表达盒酶切后定向克隆到含有CAV-2 E3区的穿梭质粒pVAX△E3中,构建出pVAX △E3VP2。用Sal I Nru I双酶切pVAX△E3VP2,回收含有目的基因表达盒部分,将其定向克隆入含有CAV-2 全基因组的骨架质粒pPoly2-CAV-2中,构建了重组质粒pCAV-2-FPV-VP2。Cla I Asc I酶切pCAV-2-FPV- VP2释放出重组基因组,以此转染MDCK细胞,获得了重组病毒CAV-2-VP2。该重组病毒能使MDCK细胞产生 腺病毒样细胞病变。Western blot检测证实,该重组病毒能表达具有免疫学活性的VP2蛋白。该重组病毒可以有 效地诱导免疫猫产生抗FPV和CAV-2抗体。本实验表明该重组病毒有可能成为一个FPV的疫苗株。     

两种基因型大豆根分泌物对大豆根腐病菌的化感作用

采用生物模拟试验、化学分析等方法,研究了两种大豆基因型（9536、吉林30）的根分泌物中的糖、氨基酸、有机酸组分对大豆根腐病菌的化感作用.结果表明,两种大豆基因型（9536、吉林30）根分泌物糖组分表现出低浓度显著促进、高浓度显著抑制半裸镰孢菌、尖镰孢菌生长的规律,对粉红粘帚菌的生长影响不明显;氨基酸组分对上述三种病原菌所表现出的促进、抑制规律不同,9536基因型根分泌物氨基酸组分的中、高浓度处理对半裸镰孢菌、粉红粘帚菌、尖镰孢菌的生长表现出显著的抑制作用,而吉林30多表现出显著的促进作用;有机酸组分对半裸镰孢菌、粉红粘帚菌、尖镰孢菌生长都有显著的抑制作用.两种基因型大豆根分泌物（糖、氨基酸、有机酸组分）与根腐病害发生密切相关,大豆基因型不同,根分泌物对根腐病菌的化感促进或抑制作用有差异.     

虎源流感病毒HA基因的系统发生分析及其在杆状病毒系统中的表达

通过对虎源流感病毒A/Tiger/Harbin/01/2003(H5N1)的HA基因进行克隆与序列测定,证明该基因全长为1731bp,读码框由1707个碱基组成,编码568个氨基酸。对HA基因的进化分析表明,该基因与H5亚型流感病毒的HA基因同源性最高,其HA裂解位点由6个碱性氨基酸插入序列(RRRKKR)组成,符合高致病性禽流感病毒的分子特征。将HA基因克隆入杆状病毒转座载体质粒pFastBacⅠ,构建重组质粒pFastBacHA;再将该重组质粒转化DH10Bac感受态细菌,在体内进行重组,并经三重抗性与蓝白斑筛选,得到杆状病毒重组质粒BacmidHA;将BacmidHA转染sf9细胞,获得重组杆状病毒。经Westernblotting检测,HA蛋白在重组杆状病毒中获得表达。用感染重组病毒的sf9细胞免疫小鼠,2次免疫后2周可诱导小鼠产生1∶8～1∶16的血凝抑制抗体,表明虎源流感病毒的HA基因在重组杆状病毒系统中得到了正确表达。     

犬冠状病毒流行株膜蛋白基因序列分析及其表达研究

对国内分离的犬冠状病毒(CCoV)DXMV、V1和V2流行毒株膜蛋白(M)基因进行了扩增、测序和遗传进化分析.3个CCoV流行毒株M基因全长均为792bp,编码263个氨基酸,其中前17个氨基酸为信号肽.DXMV、V1和V2流行株与Insavc-1疫苗株M基因相比,核苷酸的同源性分别为92.6% 、90.9%和91.6%,推导的氨基酸序列的同源性分别为92.5%、92.0%和92.3% ,在M基因前1/3区域内存在变异,其中74-76、120-124和131-135三个区域变异较大.国内DXMV、V1、V2、NJ1和NJ1-17 5个流行株M基因核苷酸同源性为96.6%,推导的氨基酸序列同源性为96.4%,显示出很高的保守性.基于M基因的遗传进化分析表明,目前国内绝大多数CCoV流行毒株都属于CCoV基因II型,只有Fox3-1和Rac2-1两个毒株属于基因I型.另外,将DXMV株M基因亚克隆到pET28a中,在BL21(DE3)中实现了M蛋白的表达,表达量约占菌体蛋白的10.2%.